食品中一般成分的分析-食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

任務(wù)五食品中蛋白質(zhì)的測定難點：

基本知識點：重點：1.折射法的原理2.旋光法的原理1.凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)含量。1.食品中蛋白質(zhì)的組成，性質(zhì)及檢測意義；各種測定蛋白質(zhì)的原理、操作要點及注意事項；3.凱氏定氮儀的使用。

2.各種測定蛋白質(zhì)的原理、適用范圍及操作要點。

一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、作用及分布

蛋白質(zhì)是由20多種氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來，并具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的最小構(gòu)成單元是氨基酸。

（一）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)丙、精、天冬、半胱、谷、組、異亮、甘、天冬、亮、賴、甲硫、苯丙、脯、絲、蘇、色、酪、纈（二）蛋白質(zhì)的化學(xué)組成

蛋白質(zhì)主要含的元素是C、H、O、N、S、P另外還有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。含N是蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機(jī)化合物的重要標(biāo)志。 （二）蛋白質(zhì)的生理功能及在食品中的作用1．生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，是生物體發(fā)育及修補(bǔ)組織的原料，長期蛋白質(zhì)不足會造成負(fù)氮平衡。2．生物體的酸堿平衡、水平衡的維持；3．遺傳信息的表達(dá)方式；4．物質(zhì)的代謝及運(yùn)轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)（酶）；5．人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)；6．膳食指導(dǎo)的重要（營養(yǎng)）指標(biāo)；7．食品生產(chǎn)的重要工藝指標(biāo)，還關(guān)系到人體健康。（三）食物中蛋白質(zhì)的含量食物品種蛋白質(zhì)含量（％）食物品種蛋白質(zhì)含量（％）人乳1.5大米5.2～7.6牛乳3.2～3.3白面9.8～13.5全脂奶粉22～25玉米面7.0～9.4脫脂奶粉34～38黃豆33～42豬肉9.5花生25～38牛肉干81～90核桃15～21全蛋粉35土豆10～13脫脂蛋粉77綠藻23～44二、蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)N是區(qū)別于其它有機(jī)化合物的主要標(biāo)志N在蛋白質(zhì)的含量是相對衡定的，平均在16%左右。（一）構(gòu)成元素—N元素

蛋白質(zhì)中的AA是通過酰胺鍵結(jié)合的，在堿性條件下，具有酰胺鍵的化合物可與硫酸銅生成紫色的的絡(luò)合物（“茚三酮”反應(yīng)）。蛋白質(zhì)可以與茚三酮顯色，生成紫紅色的顯色產(chǎn)物，可用于比色分析。（二）結(jié)構(gòu)特征與對應(yīng)的反應(yīng)特性1.雙縮脲反應(yīng)—酰胺鍵3.對紫外光的特征性的吸收作用

酰氨鍵在190nm和芳香族的AA在280nm下具有最大吸光度，以此為依據(jù)可用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)的含量。

蛋白質(zhì)的側(cè)鏈中有許多酸、堿性基團(tuán)，使蛋白質(zhì)的溶液呈現(xiàn)堿性或酸性；能夠吸附色素，并與其生成“蛋白質(zhì)-色素”的沉淀?？捎蒙亟Y(jié)合法進(jìn)行比色分析。2.色素沉淀反應(yīng)—酸堿性加熱；重金屬鹽類；堿性、酸性條件下；高濃度的鹽；醇、酚類物質(zhì)（三）蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)易變性并沉淀，可利用分離沉淀法即重量分析法測定蛋白質(zhì)的含量。三、蛋白質(zhì)的測定方法和蛋白質(zhì)換算系數(shù)1．分離稱量（重量分析法）；2．放射性同位素法；3．折光法。1．凱氏定氮法（凱氏系列定氮法）2．容量分析法1．雙縮脲法（縮二脲法）；2．色素結(jié)合法；3．紫外分光光度法；4．酚試劑法。物理分析法比色分析法化學(xué)分析法（一）測定方法含N量的倒數(shù)稱為蛋白質(zhì)換算系數(shù)（K=6.25）。測定時，總氮乘蛋白質(zhì)換稱系數(shù)即為蛋白質(zhì)含量。（二）蛋白質(zhì)換算系數(shù)蛋白質(zhì)組成元素CHONSP百分比50723160～30～3GB5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法丹麥人凱道爾（J.Kjeldah）1883年提出

凱氏定氮法有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的樣品數(shù)量和儀器不同。

凱氏定氮法是將蛋白質(zhì)消化，測定其總N量，再換算成為蛋白質(zhì)含量。食品中的含N物質(zhì)，除蛋白質(zhì)中的氮以外，還包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白質(zhì)含N物質(zhì)，所以該法測定的蛋白質(zhì)含量應(yīng)稱為粗蛋白質(zhì)。1.測定原理

樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。2.反應(yīng)式及計算關(guān)系：2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3＋Na2SO4＋2H2O2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7（弱堿性）+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3N：HCl=1：1食品CHON＋H2SO4催化劑CO2H2O(NH4)2SO4消化蒸餾吸收滴定3.試劑

3.試劑與儀器硫酸銅硫酸鉀濃硫酸。40％氫氧化鈉硼酸指示劑:甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑

（1）硫酸銅的作用①催化劑可采用的催化劑有：銅、汞、硒粉。②指示劑3C+4CuSO4+2

H2SO4→2Cu2SO4+4SO2↑+3CO2↑+2H2O

Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2↑

（2）濃硫酸的作用①氧化劑②脫水、碳化碳化（變黑、起泡）→泡沫消失（仍黑色）→醬色→變棕色→變淺→透明

──如加CuSO4，則呈藍(lán)綠色；──如未加CuSO4，則為無色。（3）硫酸鉀的作用K2SO4

或Na2SO4是常用的增溫劑，提高消化液沸點。在消化過程中溫度起著重要的作用，消化溫度一般控制在360℃～410℃間。低于360℃，消化不易完全，特別是雜環(huán)氮化物，不易分解，使結(jié)果偏低，高于410℃則容易引氮的損失。

H2SO4的沸點僅為330℃。K2SO4

沸點：400℃；在消化過程中，隨著H2SO4的不斷分解，水分不斷蒸發(fā)，K2SO4濃度逐漸升高，則沸點升高，加速對有機(jī)物的分解作用。4.分析步驟（1）樣品消化①固體樣品0.2～2.0g，半固體樣品2～5g，溶液樣品15～25mL移入干燥的凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸銅、10g硫酸鉀及25mL濃硫酸小心搖勻，于瓶口置一小漏斗，45°角傾斜置電爐上通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化。

②先小火加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化（經(jīng)常轉(zhuǎn)動燒瓶）至溶液呈澄清透明的藍(lán)綠色（為加快消化速度,可分?jǐn)?shù)次加入10mL30%過氧化氫溶液，但必須將燒瓶冷卻數(shù)分鐘以后加入?。Ｈ∠侣┒?，繼續(xù)加熱0.5h～1h，冷卻至室溫。①按圖裝好蒸餾裝置（2）蒸餾、吸收②蒸餾

第一步：水蒸氣發(fā)生瓶裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。在接受瓶內(nèi)加入10mL40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。第二步：吸取10.00mL樣品消化稀釋液，由進(jìn)樣漏斗進(jìn)入反應(yīng)室，以少量水沖洗進(jìn)樣漏斗，并流入反應(yīng)室。再從進(jìn)樣口加入400g/L氫氧化鈉10mL使溶液呈強(qiáng)堿性，用少量蒸餾水洗漏斗數(shù)次，蓋塞，進(jìn)行水蒸氣蒸餾。第三步：蒸餾瓶變?yōu)榫G色開始記時，繼續(xù)蒸餾10min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。（3）滴定

將接受瓶內(nèi)的硼酸液用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點，即反應(yīng)液由藍(lán)綠色轉(zhuǎn)為灰紫色。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。5.結(jié)果計算式中w—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；

V1—空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL；

V2—試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL；

m—樣品質(zhì)量，g；0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；

F—蛋白質(zhì)系數(shù)。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。（1）所用試劑應(yīng)用無氨蒸餾水配制。（2）消化時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的炭粒沖下，以促進(jìn)消化完全。（3）樣品含脂肪或糖較多時，加少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑，防

止其溢出瓶外，并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。（4）若樣品消化液不易澄清透明，可將凱氏燒瓶冷卻，加入300g/L2～

3mL過氧化氫后再加熱。（5）若取樣量較大，可按每克試樣5mL的比例增加硫酸用量。（6）消化時間一般約4小時左右即可，消化時間過長會引起氨的損失。

一般消化至透明后，繼續(xù)消化30min即可。有機(jī)物如分解完全，分

解液呈藍(lán)色或淺綠色。但含鐵量多時，呈較深綠色。6.說明及注意事項（7）蒸餾過程應(yīng)注意接頭處無松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。（8）硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40°C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。（9）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。二、乙酰丙酮-甲醛比色法1.測定原理

食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中，銨與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4二氫化吡啶化合物，在波長400nm處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。2.儀器分光光度計；電熱恒溫水浴鍋(100℃±0.5℃)；10mL具塞玻璃比色管。GB/T5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》第二法樣品消化用試劑：同凱氏定氮法氫氧化鈉溶液(300g/L)：對硝基苯酚指示劑溶液(1g/L)

乙酸溶液(1mol/L)

乙酸鈉溶液(1mol/L)乙酸鈉－乙酸緩沖溶液3.試劑

氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(l.0g/L)氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(0.1g/L）二、乙酰丙酮-甲醛比色法（1）試樣消解

同凱氏定氮（2）試樣溶液的制備

精密吸取2mL～5mL試樣或試劑空白消化液于50mL～100mL容量瓶內(nèi)，加1滴～2滴對硝基酚指示劑溶液(1g/L)，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液(300g/L)中和至黃色，再滴加乙酸(1mol/L)至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻。4.分析步驟二、乙酰丙酮-甲醛比色法（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（相當(dāng)于NH2－N0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0μg），分別置于10mL比色管中。加4mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液(pH4.8)及4mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100℃水浴中加熱15min。取出用水冷卻至室溫后，移入1cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長400nm處測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算直線回歸方程。二、乙酰丙酮-甲醛比色法（4）試樣測定

精密吸取0.5mL～2.0mL(約相當(dāng)于氮小于1001μg)試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于10mL比色管中。加4mL乙酸鈉－乙酸緩沖溶液(pH4.8)及4mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100℃水浴中加熱15min。取出用水冷卻至室溫后，移入1cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長400nm處測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算直線回歸方程。試樣吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程求出含量。二、乙酰丙酮-甲醛比色法5.計算結(jié)果式中:w—試樣中蛋白質(zhì)的含量，(g/100g或g/100mL)；cco—試劑空白測定液中氮的含量，(μg)；c—試樣測定液中氮的含量，(μg)；V1—試樣消化液定容體積，(mL);V2—制備試樣溶液的消化液體積，(mL);V3—