功能基因表達載體的構(gòu)建

天津師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)期末試驗報告試驗名稱：功能基因表達載體的構(gòu)建11級水生生物李雪靜11101700362023-1-20一、 試驗?zāi)康模簶?gòu)建功能基因kazal的表達載體。二、試驗流程：基因克隆——→小片段〔kazal〕制備、大片段制備——→kazal基因與目標(biāo)載體連接——→蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達三、試驗過程〔一〕202366日上午：PCRA試驗原理：PCR〔polymerasechainreaction〕KaryMullis1985年建立起來的DNADNA半保存復(fù)制原理，利用DNA聚合酶依靠于DNA模板的特性，在附加的兩個引物與模板雜交之后，按堿基配對原則經(jīng)酶促反響合成DNA片段，包括模板變性、引物退火及用DNA聚合酶延長兩個引物之間DNA的肯定次數(shù)的重復(fù)循環(huán)，使包括在兩個引物5′端限定的特異性片段形成指數(shù)式積存。整個過程操作簡潔，可在短時間內(nèi)在小管中獲得大量的特異的DNA拷貝，這PCRDNA要取決于引物和模板相結(jié)合的特異性，每個循環(huán)的反響分為3模板變性templatedenaturatio：通過加熱使DNA于溶液中的單鏈DNA。退火annealin：溫度突然降低，反響體系中的引物能準(zhǔn)確地配對于被擴增區(qū)域的兩個側(cè)翼。這是由于模板分子構(gòu)造比引物的構(gòu)造簡單得多，而且引物的拷貝數(shù)遠高于DNA的拷貝數(shù)，因此引物與模板DNADNA單鏈的重結(jié)合。延長extensio：在DNA4種脫氧核糖核苷三磷酸及M2存在的條件下，DNA5′--3′DNA鏈延長反響。n個循環(huán)后，一個模板2n-1。試驗步驟：以菌液為模版，進展PCR反響，擴增目標(biāo)基因。2l反響體系為： 1×PCRbuffe〔M2〕2.5μLdNTP2μLExTaqDNAPolymerase0.2μL水〔滅菌的去離子水〕15.875μL模板1μL上游引物1μL下游引物1μL反響條件為：94℃，4min94℃，1min60℃，1min 25cycle72℃，1min72℃，10min15℃，保溫年6月7日 電泳檢測kazal基因及回收kazalT載體電泳檢測：0.2g30mL400μLTAE電泳緩沖液，置微波爐中加熱至液體完全澄清，取出后搖勻，冷卻到50℃左右，參加EB染料1μL，搖勻，使之完全溶解倒入插有梳子的制膠槽中(留意不要形成氣泡)，凝膠厚度一般為1cm左右，室溫冷卻30～40min。待膠凝固后，取出梳子并將凝膠放入電泳槽中，參加足夠的1×TAE電泳緩沖液，掩蓋凝膠約1mm，用移液槍將已經(jīng)參加3μL上樣緩沖液的樣品和Marker分別參加到加樣孔中(記錄點樣挨次及點樣量)。接通電泳儀電源(留意正負極，RNA片段從負極向正極移動)?！?〕30分鐘左右后，將凝膠放入凝膠成像儀內(nèi)觀看、照相。2.1.1試驗結(jié)果：割膠回收在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠外表液體并切碎。計算凝膠重量〔提前紀錄1.5mL離心管重量〕，該重量作為一個凝膠體積〔100mg=100μL體積。參加3個凝膠體積的BufferDE-A，混合均勻后于75℃加熱，連續(xù)混合〔每2—3mi，直至凝膠完全熔化6—8mi。0.5BufferDE-ABufferDE-BDNA片段小段小魚400bp1個凝膠體積的異丙醇。3DNA制備管〔2mL離心管〕中，1200×g，離1min，棄濾液。2mL500μLBufferW1，12023×g30s，棄濾液。2mL700μLBufferW2，12023×g30s，棄濾液。700μLBufferW2洗滌一次，12023×g，離心1min。〔W2中參加指定體積無水乙醇〕2mL離心管中，12023×g1min。1.5mL25—30μLEluent或去離子水，室溫1min，12023×g1min。T載體連接〔冰上操作〕5μL體系 solutionΙ 2.5μLDNA T載體 0.4μL混勻后離心，16℃過夜培育。〔三〕202368E.coliTOPO感受態(tài)細胞的制備202368日下午：E.coliTOPO感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化制備感受態(tài)細胞25gLBBrothMedium1L蒸餾水，加熱溶解后分裝在試管中〔每管3m。滅菌后冷卻備用。搖菌：取保好的菌種50μl參加到3ml培育基〔無Amp〕中，37℃，180rpm，搖菌過夜。目的：使菌體充分生長，增加菌體的濃度菌種復(fù)搖：將前夜搖菌〔37℃，180rpm，無Amp〕拿出，抽100μL于3mLLB培育基〔無Amp〕2—3h，當(dāng)看到綢緞樣取出。目的：上述菌液經(jīng)過搖菌一夜后，確定過了對數(shù)生長期，所以為了獲得對數(shù)生長期的菌液，須再在一個的環(huán)境里搖1-2h，使還存活的菌連續(xù)生長到達對數(shù)期，而生特長于末期的菌在的培育基里也不會存活。1mLEP管中離心，3000rpm，3mim1mL。2超凈工作臺下，吸取殘留上清，每EP100μLCacl〔0.1M〕4℃輕柔反復(fù)24℃冰箱，3h后可用?！睠aCl2的作用：在沉淀中參加CaCl2以后，Ca2+會形成羥基鈣磷酸復(fù)合物，它可以吸附在大腸桿菌細胞的外表，作用①使大腸桿菌細胞膜膨脹，膜的流淌性變差，呈現(xiàn)晶格狀態(tài)，進而易使連接產(chǎn)物進入到細胞當(dāng)中；②抗DNA酶，防止把轉(zhuǎn)化的DNA片段打斷〕轉(zhuǎn)化制培育基平板：已滅菌的LB培育基在摸著不燙手的時候，參加氨芐，之后倒平板?！惨话?ml培育基中加1l氨芐母液，氨芐母液1ml溶液中有0.1g氨芐〕100μL5—10μL30min。〔2〕4290s2-3min800μl培育基〔無Amp〕，45分鐘，條件：37℃，150rpm?！材康模鹤尵M一步生長，擴大濃度〕3000rpm5min900μl100μl上清與沉淀混勻。在超凈臺中，取此菌液涂在平板上，37℃倒置培育。〔說明：由于T載體上有抗氨芐的基因，因此涂平板后，已轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌感受態(tài)細胞可生長成為單克隆菌落，未轉(zhuǎn)化成功的將不會生長。留意：①感受態(tài)最好現(xiàn)用現(xiàn)制，最多不能超過24h，但假設(shè)為了避開每次現(xiàn)用現(xiàn)制太麻煩而制了一大批，則可以把它放入液氮中速凍，然后取出保存在-80℃的冰箱1②搖菌震蕩的時候，大的試管和錐形瓶可以垂直放著搖，但小的管則要水平放置著搖，這樣才會搖的比較均勻充分；③在平板中培育菌體時，平板要倒置，防止蒸發(fā)的水分落在平板的菌落上〕〔四〕202369日上午挑克隆3μlAmp3mlLB培育基中。將參加AmpLB6個EP500μl。將過夜培育的平板取出，在超凈工作臺中，用黃色槍頭挑一個單克隆菌落，在〔2〕中的培育基中蘸一下。〔4〕37℃，180rpm，4-5h后檢測?！参濉?02369PCRKazal電泳檢測2023610PCR反響檢測Kazal基因2l反響體系為：混合液buffe，loadin，m2，酶〕 12.5μL水〔滅菌的去離子水〕 10μL模板〔菌液〕 1μL上游引物 1μL下游引物 1μL反響條件為：94℃，4min94℃，1min60℃，1min 25cycle72℃，1min72℃，10min15℃，保溫電泳檢測：0.2g30mL400μLTAE電泳緩沖液，置微波爐中加熱至液體完全澄清，取出后搖勻，冷卻到50℃左右，參加EB染料1μL，搖勻，使之完全溶解倒入插有梳子的制膠槽中(留意不要形成氣泡)，凝膠厚度一般為1cm左右，室溫冷卻30～40min。待膠凝固后，取出梳子并將凝膠放入電泳槽中，參加足夠的1×TAE電泳緩沖液，掩蓋凝膠約1mm，用移液槍將PCR反響產(chǎn)物和Marker分別參加到加樣孔中(記錄點樣挨次及點樣量)。接通電泳儀電源(留意正負極，RNA片段從負極向正極移動)?！?〕30分鐘左右后，將凝膠放入凝膠成像儀內(nèi)觀看、照相。試驗結(jié)果：條帶大小與目標(biāo)基因的大小全都，即可確定其為Kazal基因。保種3mlLB3μlAmp80μl菌液。37℃，180rpm培育。搖菌4-5，當(dāng)試管中的液體呈綢緞狀時，從中取出1ml參加20l后-20℃保存。其余菌液連續(xù)搖，搖到很濃時取出1ml〔六〕2023610LB培育基+氨芐TOPO10菌種取保種的TOPO菌液50μl參加3ml培育基中，37℃，180rpm，培育過夜〔這種質(zhì)粒含有氨芐抗性基因〕LB50μl3ml基中，37℃，180rpm〔T體上有氨芐抗性基因〕〔七〕2023611質(zhì)粒提取柱平衡步驟：向吸附柱CP3中〔吸附柱放入收集管中〕參加500μl的平衡液BL，12023rpm1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重放回收集管中。取1-5ml過夜培育的菌液，參加離心管中，使用常規(guī)臺式離心機，12023rpm離心1min，盡量吸除上清。向留有菌體沉淀的離心管中參加25l溶液P〔請檢查是否已參加RNase移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。留意：假設(shè)有為徹底混勻的菌塊，會影響裂解，倒置提取量和純度偏低。250μl溶液P26-8次使菌體充分裂解。留意：溫順地混勻，不要猛烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA5min，以免質(zhì)粒收到破壞。假設(shè)未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)削減菌體量。向離心管中參加350μl溶液P3，馬上溫順地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時將消滅白色絮狀沉淀，12023rpm10min，此時在離心管底部形成沉淀。留意：P3參加后應(yīng)馬上混合，避開產(chǎn)生局部沉淀。假設(shè)上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后去上清。將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中〔吸附柱放入收集管中，留意盡享不要吸出沉淀，12023rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中參加60μl漂洗液P〔請先檢查是否已參加無水乙醇，12023rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。7CP3放入收集管中，12023rpm離心2min，目的是將吸附柱中剩余的漂洗液除去。留意：票寫后在那個乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反響〔酶切，PCR等〕試驗，為確保下游試驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP3開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中剩余的漂洗液，將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100μl洗脫緩沖液EB2min，12023rpm2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。留意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μl，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。假設(shè)后續(xù)做測序，需使用去離子水做洗脫液，并保證pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)〔可以用NaOH將水的pH調(diào)到此范圍，pH低于7.0會降低洗脫效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得2min，12023rpm離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。雙酶切雙酶切體系〔50μl〕ddH2O 20μl10×KBuffer 5μl〔不同的酶需要用不同的Buffer，可以通過查相應(yīng)表得知，今日用的兩種酶查表得它們的交點為1×KBuffer10×KBuffer，按比例稀釋即可〕提取的質(zhì)粒20μlBamHⅠ2.5μlG↓GATCC37℃HindⅢ1μlA↓AGCTT30℃33-344h7.4目的片段與TOPO10質(zhì)粒連接〔1〕4h后跑電泳，進展割膠回收。MM123456單數(shù)孔道上部的條帶為T載體，分子量大于