第三章核酸技術(shù)課件

第三章核酸技術(shù)

第三章1核酸的分離和純化核酸電泳染色體DNA電泳DNA限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制DNA的連接PCR技術(shù)分子雜交技術(shù)核酸序列的測定核酸的分離和純化2第一節(jié)核酸的分離和純化第一節(jié)3一、一般程序

1、供體的核酸分離

供體細(xì)胞培養(yǎng)收集(菌體)細(xì)胞細(xì)胞破碎分離總DNA分離細(xì)胞器分離總RNA分離細(xì)胞器DNARNApoly(A)RNA特異性RNA

染色體DNA(組建基因組文庫)一、一般程序42、載體DNA分離

載體DNA感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞（病毒型）轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（質(zhì)粒型）分離病毒顆粒培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集菌體

病毒載體DNA分離與純化破碎細(xì)胞

質(zhì)粒DNA分離與純化3、DNA片段的分離DNA限制酶切凝膠電泳分離特定DNA片段的回收2、載體DNA分離54、質(zhì)量評估

1）

凝膠電泳2）光密度值測定3）限制酶切分析二、細(xì)胞裂解

1.

酶法：

利用某些細(xì)胞壁裂解酶使細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體，然后加去垢劑使原生質(zhì)體裂解。1)

細(xì)菌：溶菌酶2)

酵母：蝸牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase等3)

絲狀真菌：Novozyme234、溶壁酶、纖維素酶4)

植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶酶法裂解時(shí)要注意細(xì)胞的生長條件和生長時(shí)間，反應(yīng)時(shí)盡可能滿足酶的最佳反應(yīng)條件。4、質(zhì)量評估62.

機(jī)械法1)

壓力剪切法：French壓力機(jī)，酵母細(xì)胞，細(xì)菌（芽孢和G+球菌除外）2)射擊破碎法：Braun破碎機(jī)，攪切器（blender），混合器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球3)固體研磨法：將待破碎細(xì)胞與玻璃球（0.1~0.45mm）同時(shí)致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末4)反復(fù)凍融法三、DNA的分離與純化

1、供體DNA的分離與純化要求：盡可能地保持其高分子量，無其它污染物。1)

基因組大小：2.

機(jī)械法7染色體細(xì)菌3300~4200kb酵母15,000kb果蠅1.28x105kb人3x106kb植物2x105~1x108kb天花病毒288kb痘病毒196kb質(zhì)體幾~100以上kb線粒體

藻類線狀15kb酵母環(huán)狀19~78kb植物環(huán)狀100~150kb動物(扁蟲到人)環(huán)狀15~18kb錐蟲網(wǎng)狀6000

kb(幼體)短膜蟲網(wǎng)狀30,000

kb(幼體)(Kinetoplast）葉綠體雙子葉植物121（菠菜）~154kb（豌豆）單子葉植物151（玉米）~182kb（浮萍）藻類132（裸藻）~191kb（衣藻）染色體8

1)

DNA分離純化過程

破碎細(xì)胞+DNA抽提液(EDTA、去污劑、還原劑)65℃溫育20’冰浴冷卻離心去細(xì)胞碎片苯酚抽提法①

CsCl密度梯度離心②1)苯酚抽提法上清液緩沖液用水飽和苯酚抽提2~3次上層液相用氯仿抽至界面無蛋白變性物上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗滌,干燥溶于緩沖液加入RNAase處理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥1)

DNA分離純化過程92)CsCl密度梯度離心上清液加入固體CsCl與EtBr溶液室溫下超速離心(45,000rpm）16小時(shí)穿孔取出DNA（320nm）異丙醇抽提溴乙錠緩沖液透析除去殘余CsCl兩倍體積冷乙醇沉淀DNA離心、洗滌、干燥*兩種方法比較：CsCl法操作步驟少，分離DNA分子量大，耗財(cái)多，且需超速離心機(jī)。苯酚法耗時(shí)少，不需昂貴儀器，但操作步驟多，易使DNA分子斷裂。若小心操作，所獲DNA亦符合要求。**上述兩種分離方法都包含了下述四個(gè)分離步驟ⅰ.可溶與不可溶物分離：高速離心除去細(xì)胞碎片，保留上清液。ⅱ.使蛋白質(zhì)分離：苯酚抽提或超速離心ⅲ.使RNA分離：RNase處理或超速離心ⅳ.使DNA與其它可溶物分離2)CsCl密度梯度離心102.

載體DNA的分離與純化

1)

質(zhì)粒載體DNA的分離關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA分開原理：質(zhì)粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA抽提過程中，染色體DNA斷裂成小片段(線狀)，質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型

3)

細(xì)胞器DNA的分離

植物組織用核分離緩沖液勻漿過濾濾液離心(2000g,10’,4℃)核緩沖液使核裂解(含0.5%TritonX-100)抽提DNA植物組織細(xì)胞器緩沖液勻漿離心(100g,10’,4℃)除去細(xì)胞核離心(1800g,10’,4℃)分離葉綠體離心(10,000g,10’,4℃)分離線粒體DNase除去細(xì)胞器外DNA加入EDTA使DNase失活純化細(xì)胞器細(xì)胞器裂解提取DNA2.

載體DNA的分離與純化3)

細(xì)胞器DN11

方法：ⅰ.超速離心：利用兩種DNA分子的大小和空間構(gòu)型ⅱ.變性法：在變性條件下使染色體DNA變?yōu)閱捂?，而質(zhì)粒DNA仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)變性條件發(fā)生迅速變化時(shí)，前者仍不能復(fù)性，而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型。變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNARF型的分離,質(zhì)粒DNA的氯霉素?cái)U(kuò)增使用并不廣泛（菌株和載體）

2)

噬菌體載體DNA的分離純凈病毒顆粒病毒載體DNAM13mp載體可采用質(zhì)粒DNA的分離方法方法：12

二、RNA的分離與純化

1.

制備RNA的關(guān)鍵—防止內(nèi)外源RNase的作用1)

RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;抗高溫嚴(yán)寒(0~65℃均具活性）；抗變性劑2)

解決辦法：外源RNase—高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者帶手套內(nèi)源RNase—高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等

2.

總RNA的制備根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法：1）熱苯酚抽提法2）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍3）LiCl/尿素法二、RNA的分離與純化13其中以胍鹽法最好，對于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA有較高翻譯活性。在RNA制備中，細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的。3.

多聚核糖體RNA的制備1)

多聚核糖體的分離①超速離心法（30-40萬g，離心2-3h）②鎂鹽沉淀法（0.1MMg++）③分級分離法—分離特異性多聚核糖體

其中以胍鹽法最好，對于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）14

i.結(jié)合與游離核糖體的分離，這種方法可避免溶酶體破裂。ii.核糖體大小分級分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的多聚核糖體iii.核糖體免疫沉淀法

*直接免疫沉淀法新生肽鏈+抗體蔗糖密度梯度離心

**間接免疫沉淀法新生肽鏈+抗體+抗-抗體（二抗）不可

溶復(fù)合物離心分離

i.結(jié)合與游離核糖體的分離，這種方法可避免溶酶15

***免疫親和層析法新生肽鏈-抗體復(fù)合物不溶性交聯(lián)抗原基質(zhì)親和層析柱吸附洗脫免疫沉淀法優(yōu)點(diǎn)：可分離到含量僅為1%的mRNA，但必須使用高純度的抗體，不能發(fā)生交叉反應(yīng)和污染核酸酶2)

多聚核糖體RNA的分離純化多聚核糖體+SDS蔗糖密度梯度離心或蛋白酶K-苯酚抽提

4.

RNA的分級分離

1)

分子量大小分級分離i.

蔗糖密度梯度離心ii.

凝膠電泳

2)

核酸序列分級分離i.

分子雜交法：適用于同源性很高的RNA的分離DNA分子變性結(jié)合到NCFRNA·DNA雜交洗滌洗膜乙醇沉淀***免疫親和層析法新生肽鏈-抗體復(fù)合物16ii.

親和層析法：低聚dT纖維素:用于poly(A)較長的mRNA；多聚U瓊脂糖:用于poly(A)較短的mRNA（<20A）RNA進(jìn)樣吸附洗滌洗脫收集260nm處吸收峰樣品乙醇沉淀iii.

無poly(A)mRNA的分離純化多聚核糖體核糖體亞基+mRNP離心mRNP蛋白酶KmRNA低聚（dT）纖維素層析洗出液乙醇沉淀（無多聚AmRNA）

5.

RNA的質(zhì)量評估方法1)光密度值測定法A260/A280=2.02)凝膠電泳3)體外蛋白質(zhì)翻譯ii.

親和層析法：17細(xì)胞裂解物

胍鹽法

總RNA分子雜交法—

特異RNA分子

熱苯酚法凝膠電泳圍RNA大小分級分離大小范蔗糖密度梯度離心

一定

LiCl/核酸序列

尿素法離心分級分離親和層析法—poly（A）RNA分子

高速離心法

全部多聚核糖體

上清液鎂鹽沉淀法蔗糖密度梯度離心—結(jié)合與游離多聚核糖體分級分離法

蔗糖連續(xù)密度—一定范圍大小核糖體多聚核糖體RNA免疫沉淀法——特異性多聚核糖體

細(xì)胞裂解物胍鹽法總RNA18第二節(jié)核酸電泳

第二節(jié)19

1.

種類

1)按凝膠材料分:聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖)2)按電泳裝置分:水平式/瓊脂糖凝膠;豎式/聚丙烯酰胺凝膠3)兩種方法比較：分離效果和分離范圍;操作難易

2.

用途

瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。

3.

凝膠電泳的一般程序制膠點(diǎn)樣電泳染色觀察二、DNA電泳

1.

DNA分子種類1)線狀DNA—單鏈與雙鏈，ss-DNA電泳時(shí)要注意局部區(qū)域形成ds-DNA，造成遷移距離不確定2)環(huán)狀DNA—單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒DNA）

3)線狀ds-DNA電泳—使用頻率最高的一種電泳1.

種類20

這類DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個(gè)因素的影響：i.

分子量的大小:遷移距離與分子量的常用對數(shù)成反比ii.凝膠濃度:濃度越高，移動距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動距離越長，適合分離高分子量DNAiii.電壓:低電壓時(shí)，遷移率與電壓成正比；電壓增高時(shí)，不同大小DNA片段遷移率增大是不同的。iv.堿基組成與溫度:不受影響,溫度高可導(dǎo)致DNA帶變形或解鏈。這類DNA分子在電泳過程中遷移的距離214)環(huán)狀ds-DNA電泳:常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定5)線狀ss-DNA電泳鏈分離凝膠：化學(xué)定序時(shí)，用于單鏈分離。DNA雙鏈互補(bǔ)，但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時(shí)形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。

核酸定序凝膠(染料指示劑)：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）4)環(huán)狀ds-DNA電泳:常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定22三.RNA凝膠電泳

方法：不同的RNA電泳方法是依據(jù)使RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使RNA分子在點(diǎn)樣時(shí)是一級結(jié)構(gòu)，而且在整個(gè)電泳過程中也保持一級結(jié)構(gòu)。1.

乙二醛/二甲基亞砜法原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止GC堿基的互補(bǔ)作用發(fā)生步驟：RNA+10mM羥甲基醛和50%DMSO混合50℃、1h變性點(diǎn)樣電泳染色觀察

2.

羥甲基汞法原理：羥甲基汞可與RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。步驟：RNA+10mM羥甲基醛點(diǎn)樣在含4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上電泳染色觀察三.RNA凝膠電泳233.

甲醛法步驟：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺點(diǎn)樣在含2.2M甲醛瓊脂糖凝膠上MOPS緩沖液電泳染色觀察其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于RNA電泳.4.

三種方法的比較第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的RNA樣品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。五、蛋白質(zhì)電泳方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為SDS。差別：有無變性劑用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過程中，可直接用于酶促反應(yīng)（顏色變化）SDS可用于蛋白質(zhì)分子量、亞基組成的測定。mRNA翻譯產(chǎn)物，基因表達(dá)產(chǎn)物測定等。3.

甲醛法24五、核酸片段的分離與回收

1.方法—用于DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的回收1)

電洗脫法:利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它介質(zhì)中；2)濾紙法—核酸凝膠染色長波紫外光確定位置在分離帶前方切一口子并插入濾紙條(其背面覆蓋透析袋膜)電泳至DNA帶全部進(jìn)入濾紙條洗脫DNA純化、沉淀3)透析袋法—切下含DNA帶瓊脂塊放入透析袋，封口放入電泳槽電泳2~3小時(shí)至全部DNA離開凝膠塊反向電泳1分鐘取出DNA液純化、沉淀4)凍融法5)酶解法

五、核酸片段的分離與回收25待回收DNA切口

DNA切口

凝膠塊

濾紙法

透析袋

凝膠塊

待回收DNA

透析袋法

待回收DNA

凝膠塊

V-型槽

電洗脫槽法

回收DNA方法

待回收DNA切口DNA切口凝膠塊濾紙法262.影響回收率的因素1）DNA分子大小—回收率與分子量大小呈負(fù)相關(guān)；2）乙醇沉淀—其中溫度、時(shí)間和DNA濃度（回收時(shí)體積）均與回收率有關(guān)；3）離心時(shí)間—時(shí)間越長，效果越好，對低濃度DNA尤其明顯。3.回收DNA片段質(zhì)量

凝膠材料的質(zhì)量，如瓊脂糖中的硫酸鹽沉淀劑若改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、鹽、聚丙烯酰胺及蛋白質(zhì)等。2.影響回收率的因素27第三節(jié)

染色體DNA電泳第三節(jié)28一、

DNA分子在凝膠電泳中的移動

1、常規(guī)電泳在自由電場中，DNA的移動速度與分子量大小無關(guān)；將DNA分子置于凝膠中進(jìn)行電泳，DNA移動距離與分子量有關(guān)。分子量小的移動快；反之則慢。大于20kb的DNA大分子，其移動距離與分子量無關(guān)。因?yàn)檫@些DNA分子要通過膠孔時(shí)必須發(fā)生變形，并沿分子長軸運(yùn)動經(jīng)過膠孔，它們都以相同速度前進(jìn)，分辨率也就消失了。

2、脈沖場凝膠電泳(pulse-fieldgelelectrophoresis，PFGE)

PFG工作假說1)

DNA松弛時(shí)間：大分子DNA改變形狀和重新定向所需的時(shí)間。這個(gè)時(shí)間與DNA分子量呈正相關(guān)（Tr）2)

DNA移動時(shí)間：DNA分子向前移動的時(shí)間（Tm）3)

電場脈沖時(shí)間：其電場方向所持續(xù)的時(shí)間（Tp）一、

DNA分子在凝膠電泳中的移動29分子量大的DNA分子所需的松弛時(shí)間長，分子量小的則短。由于脈沖時(shí)間是一個(gè)人為的固定值，那么用于向前移動的時(shí)間則隨分子量大小而變化。分子量大的用于向前運(yùn)動的時(shí)間少，移動距離就短，分子量小的用于向前運(yùn)動的時(shí)間多，移動距離就長。這就是使不同大小分子量DNA分離的假說。

Tp小=Tm小+Tr小Tp大=Tm大+Tr大因Tp小=Tp大，Tr小<Tp小，故Tm小>Tm大，所以，S小>S大

顯然，要使一個(gè)DNA樣品中不同大小的DNA分子分離，脈沖時(shí)間應(yīng)選在最大DNA分子所需的上限。二．脈沖場凝膠電泳的種類

1．正交場脈沖凝膠電泳（OFAGE）利用兩個(gè)或多個(gè)交變電場，使200-3000kb的DNA分子發(fā)生分離，其電極排列可以是雙向非均勻，單向非均勻等。分子量大的DNA分子所需的松弛時(shí)間長，分子量30脈沖場凝膠電泳原理圖

北

南

脈沖場電泳常規(guī)電泳

兩組電極，排列不均勻;一組電極，電場方向不變，電極排列均勻，定時(shí)改變電場方向，DNA分子的凈DNA移動方向與電場方向相同。整個(gè)電泳移動方向與兩電場呈45o，在電泳過過程保持電壓穩(wěn)定。常規(guī)方法制備DNA程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而樣品增加，制備DNA樣品與常規(guī)方法不同脈沖場凝膠電泳原理圖北南脈沖場電泳31

2.場倒置凝膠電泳（FIGE）

利用常規(guī)電泳槽進(jìn)行電泳，但電場方向則是周期性地發(fā)生倒置，其正向和反向的脈沖時(shí)間長度之比為3或其它比值。該法可使15-700Kb或以上的DNA分子發(fā)生分離。為了克服同移動現(xiàn)象產(chǎn)生（即不同大小DNA分子一起移動），可以采用轉(zhuǎn)換時(shí)間遞增法（swiching-intervalramps）,即由電泳開始時(shí)的短脈沖時(shí)間逐漸遞增到電泳結(jié)束時(shí)的長脈沖時(shí)間。如開始時(shí)為60：20，結(jié)束時(shí)可為180：60。上述兩種方法也可聯(lián)合使用，使一些很難分開的大分子DNA分離。

3.CHEF(Contour-ClampedHomogeneousElectricFields)動態(tài)調(diào)控閉合均一電場電泳2.場倒置凝膠電泳（FIGE）32120場倒置電泳

CHEF(動態(tài)調(diào)控閉合均一電場電泳)120場倒置電泳CHEF(動態(tài)調(diào)控閉合均一電33各種脈沖場凝膠電泳技術(shù)的比較

方法染色體帶最大帶最小帶動態(tài)調(diào)節(jié)直道均勻電場液體樣品機(jī)械轉(zhuǎn)換CHEF1512000kb88bp是是是是不OFAGE139000kb5000bp不不不是不TAFE139000kb2000bp不是不不不FIGE112000kb200bp不是是是