質(zhì)粒DNA的雙酶切課件

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)讓學(xué)生掌握質(zhì)粒DNA雙酶切的原理和操作方法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)讓學(xué)生掌握質(zhì)粒DNA雙酶切的原理和操作1二、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。每一種內(nèi)切酶能識(shí)別DNA分子中由4～6個(gè)核苷酸組成的特定序列多種細(xì)菌能合成限制性內(nèi)切酶，這是它們保護(hù)自己，降解外來(lái)DNA分子的重要手段。細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的DNA由于相應(yīng)序列上的A或C堿基的甲基化而不被限制性內(nèi)切酶攻擊，而外源DNA一旦進(jìn)入細(xì)胞則立即被識(shí)別，雙股DNA螺旋都被切斷，這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制性內(nèi)切酶是體外剪切基因片段的重要工具，常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶限制性內(nèi)切酶按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型二、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸2Ⅰ型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒(méi)有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無(wú)法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等Ⅱ型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見(jiàn)的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：粘性末端：是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?’……G’AA|TTC……3’3’……CT

T|AA’G…...5’|表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序。

‘表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成兩個(gè)DNA片段，各有一個(gè)單鏈末端，兩條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò)DNA連接酶的作用而“粘合”Ⅰ型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些3平頭末端：Ⅱ型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV的識(shí)別位置是：5’……GAT’|ATC……3’3’……CTA’|TAG……5’

切割后形成兩種片段，片段末端同樣可以通過(guò)DNA連接酶連接起來(lái)Ⅲ型限制性內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用于基因克隆影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：DNA的純度DNA的甲基化程度酶切消化反應(yīng)的溫度DNA的分子結(jié)構(gòu)溶液中離子濃度及種類緩沖液的pH值平頭末端：Ⅱ型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生4雙酶切的兩種酶介紹XhoⅠ酶（TaKaRa公司）識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：EcoRⅠ酶（TaKaRa公司）識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：雙酶切的兩種酶介紹XhoⅠ酶（TaKaRa公司）5三、儀器、材料與試劑水浴鍋移液槍和槍頭制冰機(jī)浮板R-pGEX-4T-1質(zhì)粒DNAXhoⅠ酶EcoRⅠ酶10×HBuffer無(wú)菌水小離心管三、儀器、材料與試劑水浴鍋6四、實(shí)驗(yàn)步驟質(zhì)粒DNA的雙酶切反應(yīng)體系：反應(yīng)條件：溫度37℃，酶切1.5h瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果紫外線投射儀觀察結(jié)果UVP凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果（電泳圖）EcoRⅠ1μLXhoⅠ1μL10×HBuffer2μL質(zhì)粒DNA10μL～12μL≤1μg無(wú)菌水6μL～4μL總體積20μL（無(wú)菌水補(bǔ)至總體積）四、實(shí)驗(yàn)步驟質(zhì)粒DNA的雙酶切EcoRⅠ1μLXhoⅠ1μL7五、思考題Ⅱ型限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的特點(diǎn)是什么？這種酶的切割有兩種方式，