亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥機制研究

亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥機制研究

銅綠假單胞菌屬假單胞菌，是醫(yī)院感染的常見病原體。碳青霉素類抗生素是目前臨床治療銅綠假單胞菌感染最有效的藥物之一。近年來,國內(nèi)外文獻報道銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥呈逐漸上升趨勢11.1材料表面1.1.1室痰標本系統(tǒng)鑒定20株銅綠假單胞菌臨床分離株均由中山醫(yī)科大學附屬三院呼吸細菌室痰標本中分離,并經(jīng)法國BIOMERIEUX公司API20NE系統(tǒng)鑒定。標準質(zhì)控株銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922為中山大學附屬第二醫(yī)院保存菌株。1.1.2iiid公司的設計藥敏紙片:亞胺培南(IMP)、頭孢曲松(CRO)、頭孢他啶(CAZ)為英國OXIOD公司產(chǎn)品。Muller-Hinton肉湯、Muller-Hinton瓊脂均為Difico公司產(chǎn)品;L-肉湯(L-B):氯化鈉5g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母浸膏5g/L,其中胰蛋白胨和酵母浸膏為Difico公司產(chǎn)品,氯化鈉為廣州化學制劑廠產(chǎn)品。1.1.3ylsarcos系統(tǒng)Tris、2-巰基乙醇、氯唑西林、克拉維酸、頭孢噻啶和十二烷基肌氨酸鈉(N-LaurylSarcosineNa):Sigma公司產(chǎn)品;丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺:BIO-RAD公司產(chǎn)品;甘氨酸和十二烷基磺酸鈉(SDS):日本和光純藥株式會社產(chǎn)品;四甲基乙二胺(TEMED):Serva公司產(chǎn)品;蛋白質(zhì)分子量標準:上海東風生化試劑廠產(chǎn)品。1.1.4細胞粉碎機和分析方法L8-M低溫超速離心機:美國Beckman公司產(chǎn)品;DF-D恒流恒壓電泳儀:北京東方儀器廠產(chǎn)品;Mini-PROTEANⅡ垂直板電泳槽:BIO-RAD公司產(chǎn)品;JY92-Ⅱ超聲細胞粉碎機:寧波新芝科器研究所產(chǎn)品;HZS-H水浴恒溫振蕩器:哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品;751-GW紫外分光光度計:上海分析儀器廠產(chǎn)品;分光光度掃描儀:美國Beckman公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機:美國Beckman公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1外藥過敏試驗及抗藥菌群落采用Kirby-Bauer法進行藥物MIC測定。培養(yǎng)基為Muller-Hinton肉湯,接種菌量101.2.2超聲碎細胞的制備從M-H瓊脂平板上挑取單個銅綠假單胞菌菌落到20mlL-肉湯中振蕩培養(yǎng)16h至對數(shù)生長期。然后轉種至300mlL-肉湯中,接種菌量為5%,37℃振蕩培養(yǎng)20h。7000r/min4℃離心10min收菌,用10mmol/LpH7.0PBS洗滌2次并懸浮于其中。置冰浴超聲碎菌4min,每次10s,間隔5s。5000r/min4℃離心15min,棄未破碎的細胞。取上清液4℃40000r/min離心1h,棄上清,將沉淀顆粒懸浮于10mmol/LpH7.0PBS中(內(nèi)含2%十二烷基肌氨酸鈉),室溫作用30min。將此混懸液30000r/min室溫離心30min,棄上清,并用1%十二烷基肌氨酸鈉洗滌2次。提純后的外膜蛋白懸浮于10mmol/LPH7.0PBS中。紫外吸收法測定蛋白含量。根據(jù)公式:蛋白濃度(mg/ml)=1.451.2.3蛋白質(zhì)變性分離蛋白樣品溶于等體積樣品緩沖液中,100℃加熱5min使蛋白質(zhì)變性。經(jīng)SDS-銅綠假單胞菌GE(分離膠10%)分離外膜蛋白。恒流電泳32mA1h,經(jīng)固定、考馬斯亮蘭R-250染色、脫色后觀察。1.2.4凝膠分光光度法確定oprd2的位置用標準蛋白質(zhì)分子量與電泳蛋白帶至分離膠距離在半對數(shù)坐標紙上作標準直線,根據(jù)標準直線測定分子量45KD離分離膠的距離及OprD2能被水楊酸鹽抑制的特性,確定OprD2的位置。用分光光度掃描儀測定OprD2的相對含量。1.2.5-內(nèi)酰胺酶活性測定離心收集對數(shù)生長中期菌液,置冰浴超聲碎菌,破碎后的菌液4℃離心,21000r/min,1h,上清液為β-內(nèi)酰胺酶粗提液。Nitrocefin紙片定性檢測β-內(nèi)酰胺酶,紙片由淺黃色變?yōu)槌燃t色為陽性。以0.1mmol/L頭孢噻啶為底物,在37℃、pH7.0條件下用紫外分光光度計260nm波長進行時間掃描測定酶活性。一個β-內(nèi)酰胺酶活性單位定義為每毫克蛋白酶在37℃、pH7.0條件下每分鐘水解頭孢噻啶的微摩爾數(shù)。1.2.6gimp、10gcro膠片的測定以大腸埃希菌ATCC259220.5麥氏單位均勻涂布M-H平板,中心分別貼10μgIMP、10μgCRO紙片,距紙片邊緣5mm處向外切出4個相互垂直的寬1mm、長20mm狹縫,每縫中加入待測菌酶粗提液40μl,35℃孵育過夜,觀察結果。平皿上出現(xiàn)沿槽周圍生長指向紙片的矢狀菌苔,表明該酶能水解相應的抗菌藥物。1.2.7酶粗提取液4.5%酰氯化反應對陽性株,進一步采用改良三維試驗進行酶類型篩選。如果所產(chǎn)酶能水解亞胺培南,則水解底物采用亞胺培南,于槽內(nèi)分別加入40μl酶粗提液、36μl酶粗提液+4μl克拉維酸2mmol/L、36μl酶粗提液+4μl乙二胺四乙酸(EDTA)200mmol/L、40μl磷酸鹽緩沖液100mmol/L;如果不能水解亞胺培南,則水解底物采用頭孢曲松,于槽內(nèi)分別加入40μl酶粗提液、36μl酶粗提液+4μl克拉維酸2mmol/L、36μl酶粗提液+4μl氯唑西林2mmol/L、6μl酶粗提液+4μl克拉維酸2mmol/L+4μl氯唑西林2mmol/L,35℃孵育過夜,觀察結果。1.2.8標準品溶液的貼放0.5麥氏單位待測菌菌液均勻涂布M-H瓊脂平板,中間貼10μgIMP和30μgCAZ紙片,距紙片1.5～2.5cm處貼一空白紙片,加2～3μl2-巰基乙醇原液。35℃培養(yǎng)過夜,如靠近2-巰基乙醇側IMP和CAZ抑菌環(huán)有擴大者為產(chǎn)金屬酶菌株。22.12表1顯示了0株銅綠假單胞菌對亞胺培南mic的影響2.2銅綠假單胞菌外膜蛋白譜分析亞胺培南敏感株1、2產(chǎn)生了分子量為45KDa的OprD2,而亞胺培南耐藥株OprD2均有不同程度的減少,見圖1。2.3銅綠假單胞菌oprd2的相對含量分析耐藥組OprD2相對含量(2.550±0.947)%顯著低于敏感組(4.252±0.869)%(2.4株銅綠假單胞菌的培養(yǎng)