抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)-四環(huán)素的發(fā)酵生產(chǎn)

單元三抗生素類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項目三四環(huán)素的發(fā)酵生產(chǎn)

任務(wù)二四環(huán)素的發(fā)酵生產(chǎn)（一）發(fā)酵生產(chǎn)流程（二）種子制備1.孢子制備麩皮斜面砂土管→母斜面→子斜面→種子罐→發(fā)酵罐控制要點（1）進行簡單的自然分離，（2）節(jié)約砂土管的用量。影響因子：水、麩皮目前生產(chǎn)中為了保證水質(zhì)穩(wěn)定，一般是在蒸餾水中添加0.005%MgSO4，0.01%KH2PO4，0.015%(NH4)2HPO4等無機鹽，溶解形成的水再用于配制培養(yǎng)基，所培養(yǎng)的菌落豐滿，孢子層厚，孢子質(zhì)量穩(wěn)定，還能縮短孢子的成熟期。麩皮的質(zhì)量要求為含糖6.5%，含氮2%，含磷0.6%左右，水分小于12%。加工麩皮用的小麥品種、產(chǎn)地與加工方法要穩(wěn)定。另外溫度和培養(yǎng)環(huán)境也應(yīng)嚴(yán)格控制。2.種子制備培養(yǎng)基：蛋白胨、花生餅粉、淀粉培養(yǎng)條件：30～32℃，24～27h標(biāo)志：菌絲形態(tài)處于第二期末或第三期初；菌體處于代謝旺盛階段，C、N源明顯被利用；pH值下降后又上升，達到pH＝6.0左右；培養(yǎng)液因菌絲增加而粘稠，色澤逐漸帶黃色，有少量四環(huán)素出現(xiàn)影響因子：通氣、攪拌（二）發(fā)酵工藝控制四環(huán)素生產(chǎn)一般采用二級或三級發(fā)酵方式1.培養(yǎng)基

N源：花生餅粉，黃豆餅粉，棉籽餅粉，硫酸銨，氯化銨，硝酸銨，尿素等

C源：淀粉，可溶性淀粉，葡萄糖，糖蜜，油脂等

無機鹽影響磷酸鹽對菌體生長和抗生素的合成有很大影響；鎂鹽、鈣鹽促進四環(huán)素生物合成；鐵離子及其他無機離子（如硼、鈷、鋰、鋅、鉬、鎢、鋁等），抑制四環(huán)素的生物合成;培養(yǎng)基中的CaCO3能與菌體合成的四環(huán)素結(jié)合成四環(huán)素鈣鹽（水中溶解度很低），從而降低了水中可溶性四環(huán)素的濃度，促進菌絲體進一步分泌四環(huán)素。消沫劑:植物油、動物油抑氯劑抑氯劑的作用是抑制氯原子進入四環(huán)素分子結(jié)構(gòu)，抑制金霉素的合成，增加四環(huán)素的產(chǎn)量。生產(chǎn)中加入的溴化鈉主要是讓溴和氯競爭，來抑制氯的活性。但抑氯效果不高，通常還要加入促進劑M（2-巰基苯并噻唑），溴化鈉一起作用，抑制氯進入四環(huán)素分子，使金霉素的產(chǎn)量低于5%。此外，還有2，5-巰基-1，3，4-噻二唑等有效抑氯劑。各種抑氯劑的用量約為0.0001%～0.05%2.培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度不僅影響四環(huán)素的產(chǎn)量，而且會改變金色鏈霉菌生物合成的方向。35℃以上時，只合成四環(huán)素。降低溫度，則金霉素的合成加強。一般四環(huán)素發(fā)酵溫度采用28～32℃。3.pH值的影響金色鏈霉菌生長的最適pH值為6.0～6.8，而生物合成四環(huán)素的最適pH值為5.8～6.0，在發(fā)酵不同階段可用加入葡萄糖或淀粉和氨水等來控制所需的pH值。4.溶氧的影響

培養(yǎng)12～60h的階段中菌絲量顯著增加，菌絲的攝氧率達到高峰，溶解氧水平為發(fā)酵全程中的最低值。此階段一旦出現(xiàn)任何導(dǎo)致溶解氧降低的因素，能明顯改變菌體的正常代謝，影響四環(huán)素的生物合成。因此在整個發(fā)酵期間要不斷通入無菌空氣，并加以攪拌，滿足菌體對溶解氧的要求。5.補料四環(huán)素發(fā)酵過程中需不斷補充碳源，以供給金色鏈霉菌生長和合成四環(huán)素的需求。用加氨水的方法來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，又增加了發(fā)酵液中的氮源。為了消除泡沫，補料中應(yīng)加入消沫劑。同時還要加抑氯劑，以降低金霉素的合成，提高四環(huán)素的產(chǎn)量。單元三抗生素類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項目三四環(huán)素的發(fā)酵生產(chǎn)

任務(wù)三四環(huán)素的提取和精制

根據(jù)四環(huán)類抗生素的理化性質(zhì)，可以采用沉淀法、溶劑萃取法或離子交換法，從發(fā)酵液中提取四環(huán)素。生產(chǎn)上較多用沉淀法。在提煉過程中應(yīng)特別注意防止四環(huán)素的破壞，防止其降解產(chǎn)物（差向、脫水衍生物和氧化產(chǎn)物等）污染成品。四環(huán)素的提取和精制發(fā)酵液濾液加草酸及黃血酸鹽、硼砂等，調(diào)節(jié)pH到1.6~1.9；過濾酸化沉淀加氨水和氯化鈣，調(diào)節(jié)pH到9，沉淀；過濾清液加草酸，復(fù)合物解離，四環(huán)素溶解，草酸鈣沉淀；過濾沉淀溶解四環(huán)素粗品加酸，調(diào)節(jié)pH到4.6~4.8，沉淀；過濾沉淀四環(huán)素成品純化調(diào)節(jié)pH到1.6~1.9，尿素復(fù)合物沉淀；過濾，丁醇萃取，結(jié)晶（一）發(fā)酵液的預(yù)處理1、原理在pH=4.5～7.2，四環(huán)類抗生素難溶于水，小于4大于8易溶于水。黃血鹽、硫酸鋅，能除去發(fā)酵液中的鐵離子、蛋白質(zhì)和其它多種離子色素。2、方法（1）酸化加草酸使發(fā)酵液酸化到pH=1.6～1.9，四環(huán)素轉(zhuǎn)入液體中。在低溫、短時進行。（能去除鈣離子，析出的草酸鈣能促使蛋白質(zhì)凝固，提高過濾速度。草酸價格較貴和加速四環(huán)素的差向化。）（2）加純化劑（黃血鹽、硫酸鋅）知識鏈接—四環(huán)素的異構(gòu)化反應(yīng)四環(huán)素在弱酸性（pH2～6）的溶液中，C-4二甲胺基會發(fā)生可逆的異構(gòu)化，生成差向四環(huán)素。一般情況下，pH﹤2或pH﹥9，溫度較低時，差向化速度很小。四環(huán)素類抗生素差向異構(gòu)化后，抗菌活性大大減弱，對細(xì)胞的毒性卻大大增強。如四環(huán)素，差向異構(gòu)化后，抗菌活性降低為1/6，毒性增大70倍。（二）四環(huán)素的提取1、沉淀提取法原理：

四環(huán)素+氯化鈣→四環(huán)素鈣鹽↓在pH=4.5～7.2，四環(huán)類抗生素難溶于水。方法一：濾液→pH=9.0→四環(huán)素鈣鹽↓→用草酸溶解，過濾，得濾液（四環(huán)素）→pH4.6～4.8→四環(huán)素粗堿↓→溶于草酸→活性炭脫色→pH=4.0，四環(huán)素堿成品方法二：直接將濾液調(diào)pH值至四環(huán)素等電點析出游離堿。發(fā)酵液先用酸酸化，然后加黃血鹽、硫酸鋅，過濾得濾液。濾渣以草酸溶液洗滌，濾液和洗滌液合并，控制濾液單位在7000U/ml左右，送去結(jié)晶。從四環(huán)素精堿制造鹽酸鹽，系利用其鹽酸鹽在有機溶劑中、在不同溫度下有不同的結(jié)晶速度的性質(zhì)。將四環(huán)素精堿懸浮在丁醇中，加入化學(xué)純濃鹽酸，溫度不超過18℃，迅速過濾掉不溶解雜質(zhì)，然后加熱，即有鹽酸鹽析出。析出的鹽酸鹽用無水丙酮洗滌，干燥，得四環(huán)素鹽酸鹽成品。（二）四環(huán)素的提取2、溶劑萃取法原理：

四環(huán)素+季銨堿→復(fù)合物沉淀↓不溶于水；溶于有機溶劑在pH=4.5～7.2，四環(huán)類抗生素難溶于水。方法：濾液→pH=9.0→復(fù)合物沉淀↓→有機溶劑→水溶液→pH4.8→四環(huán)素粗堿↓（三）四環(huán)素純化1.原理：四環(huán)素+尿素→pH=3.5～3.8，四環(huán)素-尿素↓

復(fù)合物不溶于水；溶于有機溶劑，分離成四環(huán)素和尿素。其鹽酸鹽在有機溶劑中，隨溫度升高，結(jié)晶速度增大。2.四環(huán)素純化方法四環(huán)素粗堿四環(huán)素溶液四環(huán)素－尿素四環(huán)素堿四環(huán)素鹽酸鹽酸化，pH1.5尿素，pH3.5丁酯萃取鹽酸鹽結(jié)晶單元三抗生素類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項目三四環(huán)素的發(fā)酵生產(chǎn)

任務(wù)一四環(huán)素類抗生素基本知識四環(huán)素類抗生素是放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，包括金霉素、土霉素、四環(huán)素及半合成四環(huán)素類抗生素。具有十二氫化并四苯基本結(jié)構(gòu)。該類藥物有共同的A、B、C、D四個環(huán)的母核，僅在5、6、7位上有不同的取代基。1.四環(huán)素類抗生素結(jié)構(gòu)

四環(huán)類抗生素的結(jié)構(gòu)

分類天然類金霉素、土霉素、四環(huán)素、地美環(huán)素（去甲金霉素）半合成類多西環(huán)素、美它環(huán)素、米諾環(huán)素等（1）光學(xué)性質(zhì)：在350nm和265nm存在特征吸收峰。2.四環(huán)素類抗生素的理化性質(zhì)（2）溶解性：兩性化合物。

2.四環(huán)素類抗生素的理化性質(zhì)呈酸堿兩性C10–酚羥基、C3、C12–烯醇型羥基（弱酸性）C4–二甲胺基（弱堿性）

等電點pH=5.4（在等電點時，四環(huán)素呈游離堿的形式，溶解度最小）。在pH=4.5～7.2，四環(huán)類抗生素難溶于水。4＞PH＞8時，可得高濃度水溶液2.四環(huán)素類抗生素的理化性質(zhì)不易溶于水，其鹽水溶性也差，故不易配成注射液。能與各種酸、堿形成鹽，鹽酸鹽最重要。（四環(huán)素、金霉素的理論效價以鹽酸鹽為標(biāo)準(zhǔn)，土霉素以游離堿為標(biāo)準(zhǔn)，1mg=1000U）（3）穩(wěn)定性固體四環(huán)類抗生素在干燥、低溫條件下較穩(wěn)定。四環(huán)類抗生素的水溶液在不同pH值下的穩(wěn)定性差別很大。一般在pH4～5左右較為穩(wěn)定。酸性條件下反應(yīng)1.脫水反應(yīng)在酸性條件下，四環(huán)素類抗生素C-6上的羥基和C-5a上氫發(fā)生消除反應(yīng)，生成無活性橙黃色脫水物。2.差向異構(gòu)化反應(yīng)在弱酸性（pH2～6）的溶液中，四環(huán)素C-4二甲胺基會發(fā)生可逆的差向異構(gòu)化，生成差向四環(huán)素。差向異構(gòu)化產(chǎn)物在酸性條件下還會進一步脫水生成脫水差向異構(gòu)化產(chǎn)物。脫水產(chǎn)物及差向異構(gòu)化產(chǎn)物抗菌活性均減弱或消失。差向異構(gòu)化產(chǎn)物對細(xì)胞的毒性比四環(huán)素毒性增大70倍。堿性條件下反應(yīng)在堿性條件下，由于氫氧根離子的作用，C-6上的羥基形成氧負(fù)離子，向C-11發(fā)生分子內(nèi)親核進攻，經(jīng)電子轉(zhuǎn)移，C環(huán)破裂，生成無活性的具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體。氧化劑四環(huán)類抗生素對各種氧化劑，包括空氣中的氧氣在內(nèi)，都是不穩(wěn)定的。堿性水溶液特別易氧化，顏色變深形成黑色。（4）形態(tài)顏色四環(huán)類抗生素都是黃色結(jié)晶性物質(zhì)，在紫外照射下可產(chǎn)生黃色熒光。3.能形成螯合物與復(fù)合物四環(huán)素尿素四環(huán)素-尿素復(fù)合物四環(huán)素尿素四環(huán)素尿素四環(huán)素-尿素復(fù)合物四環(huán)素尿素（1）在堿性的溶液中，與金屬離子形成螯合物沉淀，如：鈣、鎂、鋇離子（吸收受乳制品及二、三價陽離子影響——配伍禁忌）。（2）與其他物質(zhì)形成復(fù)合物沉淀，如：長烴鏈的季銨堿、尿素、氯化鈣等復(fù)合物不溶于水；溶于有機溶劑，分離成四環(huán)素和尿素。作用機制：四環(huán)素能夠與原核細(xì)胞中的16SrRNA

（30S核糖體的組成部分）結(jié)合，從而阻礙了氨酰tRNA與16SrRNA的結(jié)合，使得由mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過程無法進行。4.在臨床上的應(yīng)用廣譜，細(xì)菌（除銅綠假單胞菌），螺旋體、支原體、立克次體、衣原體。抑制細(xì)菌生長、作用較弱（不及青霉素類或鏈霉素類）。耐藥較嚴(yán)重急性毒性很低副作用多四環(huán)素生產(chǎn)采用合成金霉素的金色鏈霉菌菌種，通過在特定的培養(yǎng)條件下，控制產(chǎn)生菌的生物合成方向，使其產(chǎn)生95%以上的四環(huán)素。諾卡菌屬、馬杜拉放線菌屬等也能產(chǎn)生四環(huán)類抗生素。5.生產(chǎn)菌種金霉素（7-Cl-四環(huán)素）四環(huán)素金霉素生產(chǎn)菌種－金色鏈霉菌，通過在培養(yǎng)基中加入抑氯劑和氯的競爭劑時，則能合成95％的四環(huán)素。金色鏈霉菌抑氯劑四環(huán)素NaCl金霉素金霉菌誘變育種采用的方法紫外線，氮芥、乙烯亞胺，放線素K等

1959年，劉頤屏利用基因重組技術(shù)并結(jié)合誘變因素處理，獲得的金霉菌“重組2U-84”，發(fā)酵水平比出發(fā)菌株UK-81提高40％。同時還發(fā)現(xiàn)重組體菌株對誘變因素的敏感性增加，這樣更有利于獲得高產(chǎn)變種的機會。金霉菌的培養(yǎng)特征金霉菌在馬鈴薯葡萄糖等固體斜面培養(yǎng)基中生長時，營養(yǎng)菌絲能分泌金黃色色素，但其氣生菌絲卻沒有顏色。孢子在初形成時是白色的，在28℃培養(yǎng)5-7d，