抗體的純化-沉淀法

抗體的純化——沉淀法抗體的純化方法很多,最為常用的為以下四種方法，基于工業(yè)化生產(chǎn)工藝開發(fā)的規(guī)模化生產(chǎn)方法要比這些復(fù)雜得多，甚至多個(gè)純化策略聯(lián)合使用，有興趣的科研工作者可以查閱相關(guān)的文獻(xiàn)。1)沉淀法：利用抗體蛋白疏水性不同，提高鹽離子濃度蛋白沉淀，常用的沉淀方法有硫酸銨沉淀法、辛酸沉淀法、辛酸-硫酸銨沉淀法、優(yōu)球蛋白沉淀法和聚乙二醇沉淀法；這類純化各有各的優(yōu)缺點(diǎn)，往往對(duì)某些亞型抗體有偏愛性。2)廣譜親和純化：這類純化主要是利用金黃色葡萄球菌ProteinA/G蛋白可以特異性與抗體的Fc結(jié)合的原理進(jìn)行的。3)抗原特異性純化：將特異性的抗原偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠等固相載體上，純化方法與ProteinA/G純化方法相同。4)離子交換法：DEAE-SephadexA-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠A-50）為弱堿性陽(yáng)離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白（等電點(diǎn)為pH6.85～7.5），其余均屬酸性蛋白。pH7.2～7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析，γ球蛋白便可在洗脫中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的IgG。1.(NH4)2SO4沉淀法純化抗體1.1飽和硫酸銨配制：無菌去離子水加入足量硫酸銨之后，加熱到65℃以上，在磁力攪拌器上攪拌溶解至底部仍有未溶解的硫酸銨，待冷卻后，取上清濾紙過濾。1.2樣品（血清或腹水），12,000rpm離心30min（4℃），除去細(xì)胞碎片，保留上清液并測(cè)量體積。1.3邊攪拌邊緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液到上清液中，溶液放在磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?h或攪拌過夜（4℃），使蛋白質(zhì)充分沉淀。1.4蛋白溶液12,000rpm離心30min（4℃），沉淀用原樣品體積的PBS溶液重懸，重懸后12,000rpm離心10min（4℃），上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新離心管。1.5邊攪拌邊慢慢加入1/2體積的飽和硫酸銨溶液到上清液中（此時(shí)硫酸銨濃度為33%飽和），溶液放在磁力攪拌器上攪拌6h或攪拌過夜（4℃），使蛋白質(zhì)充分沉淀。1.6蛋白溶液12,000rpm離心30min（4℃），沉淀用原樣品體積的PBS溶液重懸，重懸后12,000rpm離心10min（4℃）。1.7沉淀溶解后放入透析袋對(duì)PBS溶液透析24～48h（4℃），每隔3-6h換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸銨。（硫酸銨是否透析干凈的判斷標(biāo)準(zhǔn)：可取透析袋內(nèi)少許溶液，加入等體積的0.02MBaCl2溶液，如果沒有沉淀表明硫酸根離子除盡。）硫酸銨沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是適合抗體大規(guī)模純化或者濃縮。缺點(diǎn)事某些抗體經(jīng)硫酸銨沉淀后抗體的活性會(huì)有所降低或喪失，抗體純度不高。2.辛酸-硫酸銨沉淀純化抗體辛酸-硫酸銨方法一般用于純化單克隆抗體。2.1腹水用雙層濾紙過濾，除去雜質(zhì)、脂肪及細(xì)胞碎片。4℃，12,000r/min，離心15min，收集上清，棄沉淀。精確定量腹水體積。2.2腹水中加入2～4倍體積的醋酸鹽緩沖液(0.06M，pH4.8)磁力攪拌混勻，用2MHCL調(diào)pH至4.5～4.8。2.3磁力攪拌下緩慢加入正辛酸，33μL/mL腹水，加完后室溫磁力攪拌半h，后置4℃靜置2h以上。2.44℃,12000r/min，離心5min，收集上清，雙層濾紙過濾，收集濾液。2.5量取濾液體積，加入1/10體積的0.1MPBS(pH7.4),用2MNaOH（記錄NaOH體積）調(diào)pH至7.4。2.6將上清冰浴預(yù)冷，加硫酸銨固體至0.277g/mL，邊加邊攪拌，并于30min內(nèi)加完，置4℃過夜。2.712000r/min，離心15min，棄上清;用1/10腹水體積0.01MPBS溶解沉淀;對(duì)0.01MPBS(pH7.4)透析一天，離心去掉不溶雜質(zhì)，用純水進(jìn)行透析，優(yōu)球蛋白析出后離心收集澄清抗體溶液分裝置于-20℃凍存。（辛酸-硫酸銨沉淀主要缺點(diǎn)是只適合于提純IgG1和IgG2b,不能用于IgM和IgA的純化;其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單方便,抗體回收率和產(chǎn)率均高,抗體活性損失小。）3.優(yōu)球蛋白沉淀法優(yōu)球蛋白沉淀法適用于IgG3和IgM型單抗的提取,用該法純化的抗體活性幾乎保持不變,對(duì)IgG3單抗的回收率高于90%,對(duì)IgM單抗的回收率為40%～90%。4.聚乙二醇(P