反相色譜法課件

高效液相色譜法(HPLC)基本原理一、高效液相色譜法與氣相色譜法比較①分析對(duì)象：氣相色譜法只能分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物；沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的有機(jī)物，主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析高效液相色譜法(HPLC)基本原理一、高效液相色譜法與氣相色1②流動(dòng)相作用：氣相色譜法的流動(dòng)相是惰性氣體，僅起運(yùn)載作用高效液相色譜法中流動(dòng)相不僅起運(yùn)載作用，還與固定相一起共同完成對(duì)組分的分離②流動(dòng)相作用：2③運(yùn)行環(huán)境：

氣相色譜法一般都在較高溫度下進(jìn)行分離和測(cè)定，使其應(yīng)用范圍受到了較大的限制。高效液相色譜一般在室溫下進(jìn)行分離和分析，適于分離分析生物大分子、離子型化合物、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物和各種高分子化合物如：蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料、藥物等。③運(yùn)行環(huán)境：3④HPLC除用于分離和分析外，還可用于制備注意：由于氣相色譜更快、更靈敏、更方便而且耗費(fèi)低，因此凡是能用氣相色譜法分析的樣品一般不用液相色譜法。④HPLC除用于分離和分析外，還可用于制備4二、高效液相色譜法的類型高效液相色譜法可以分為：液液分配色譜法（LLPC）液固吸附色譜法(LSAC)離子交換色譜法（IEC）離子對(duì)色譜法（IPC）離子色譜法（IC）空間排阻色譜法（SEC）親和色譜法（AC）二、高效液相色譜法的類型5反相色譜法ppt課件6三、正相色譜法

NormalphaseHPLC正相色譜法的流動(dòng)相極性小于固定相。樣品中極性小的組分先流出，極性大的后流出。正相色譜法適于分析極性化合物。氰基鍵合相以氰乙基取代了硅膠的羥基，極性比硅膠小，選擇性與硅膠相似，它主要用于可誘導(dǎo)極化的化合物和極性化合物的分析。氨基鍵合相以氨基取代了硅膠中的羥基，其選擇性與硅膠有很大的不同，主要用于分析糖類物質(zhì)。三、正相色譜法NormalphaseHPLC7總之，正相鍵合相色譜法適于分析中等極性的化合物如脂溶性維生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂和有機(jī)氯農(nóng)藥等。總之，正相鍵合相色譜法適于分析中等極性的化合物如脂溶性維生素8四、反相色譜法

ReversedphaseHPLC反相色譜法的流動(dòng)相極性大于固定相，極性大的組分先流出色譜柱，極性小者后流出，適于分析非極性化合物?，F(xiàn)用得最多的是反相鍵合相色譜法。典型的反相鍵合相色譜是在ODS柱上，采用甲醇－水或乙腈－水作流動(dòng)相，分離非極性或中等極性的化合物如同系物、綢環(huán)芳烴、藥物、激素、天然產(chǎn)物及農(nóng)藥殘留等。四、反相色譜法ReversedphaseHPLC95.正相色譜與反相色譜法比較(1)NormalphaseHPLCnonpolarsolvent/polarcolumn(2)ReversedphaseHPLCpolarsolvent/nonpolarcolumn(3)Normal-(polarcolumn)versusReversedPhase(nonpolar)elution:5.正相色譜與反相色譜法比較10反相色譜法ppt課件11(4)Reversed-phaseHPLCmostcommon(highpolaritysolvent,highpolaritysoluteselutefirst)RisC8orC18hydrocarbon(4)Reversed-phaseHPLCmostco12(4)StationaryPhaseChoiceChoosecolumnwithsimilarpolaritytoanalyteformaximuminteractionReversed-phasecolumn(nonpolar)RhydrocarbonNormal-phasecolumn(polar)

Rcyano(C2H4CN)氰基柱mostpolar

diol(C3H6OCH2CHOHCH2OH)

amino(C3H6NH2)氨基柱leastpolar(4)StationaryPhaseChoice13(5)MobilePhaseChoicePolar("strong")solventinteractsmostwithpolaranalyte(solute)–elutesfasterbutlessresolutionStrengthcharacterizedbypolarityindexP'rangesfrom-2(nonpolar)to10.2(highlypolar)(5)MobilePhaseChoice14inamixtureP'AB=φAP'A+φBP'BfractioninmixtureInHPLC,capacityfactork'canbemanipulatedbychangingsolventcompositionbestresolution/timewhenk'=2-5inamixture15反相色譜法ppt課件16反相色譜法ppt課件17HPLC日常維護(hù)（二）——色譜柱的使用和維護(hù)

HPLC日常維護(hù)（二）——色譜柱的使用和維護(hù)18每天用足夠的時(shí)間來(lái)平衡色譜柱，會(huì)在處理問(wèn)題方面獲得最大的“補(bǔ)償”，

而且色譜柱的壽命也會(huì)變得更長(zhǎng)！一定得做！

新的色譜柱在使用之前進(jìn)行性能測(cè)試，即使用色譜柱附帶的檢驗(yàn)報(bào)告上的測(cè)試條件和樣品來(lái)測(cè)定該色譜柱的柱效。并且，在以后的使用中，應(yīng)時(shí)常對(duì)色譜柱進(jìn)行測(cè)試。

每天用足夠的時(shí)間來(lái)平衡色譜柱，會(huì)在處理問(wèn)題方面獲得最大的“補(bǔ)19一、平衡色譜柱

1.反相色譜柱經(jīng)過(guò)出廠測(cè)試后保存在乙腈/水中。在用流動(dòng)相分析樣品之前，應(yīng)使用10~20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水“過(guò)渡”。一、平衡色譜柱

1.反相色譜柱202.

硅膠柱或極性色譜柱經(jīng)過(guò)出廠測(cè)試后保存在正庚烷中。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相，在使用流動(dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡。2.

硅膠柱或極性色譜柱21二、如何平衡色譜柱？

新色譜柱，應(yīng)首先用0.2ml/min的流速將色譜柱平衡過(guò)夜，然后將流速升高到1.0ml/min沖洗30分鐘，以便將色譜柱的填料充分平衡至最佳狀態(tài)。這樣可以保證色譜柱的使用壽命，并且保證在以后的使用中，獲得分析結(jié)果的重現(xiàn)性。平衡過(guò)程中，將流速緩慢地提高

用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線(緩沖鹽或離子對(duì)試劑度如果較低，則需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡)二、如何平衡色譜柱？22三、色譜柱的再生色譜柱在使用一段時(shí)間后柱效會(huì)下降，這時(shí)可以考慮對(duì)色譜柱進(jìn)行再生。進(jìn)行色譜柱再生時(shí)，應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵，我們建議：最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵。建議用來(lái)沖洗的溶劑體積

色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積

125*4mm1.6ml30ml

250*4mm3.2ml60ml

250*10mm20ml400ml三、色譜柱的再生23再生方法：

1.極性固定相的再生：

正庚烷

氯仿乙酸乙酯

丙酮

乙醇

水

2.非極性固定相的再生：

水

乙腈

氯仿(或異丙醇)

乙腈水

3.0.05M稀硫酸可以用來(lái)清洗已污染的色譜柱

再生方法：

1.極性固定相的再生：

正庚烷

氯24四、注意：1.在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。2.如果簡(jiǎn)單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，用0.05M的硫酸沖洗非常有效。四、注意：25五、色譜柱的維護(hù)

1.

使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相