基因工程制藥

基因工程制藥第1頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程藥物是應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造的重組活性蛋白、多肽及其修飾物治療蛋白、抗體、疫苗、連接蛋白和可溶性受體等第2頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時(shí)間產(chǎn)品人生長激素釋放抑制素（SRM)人胰島素首次克隆表達(dá)時(shí)間國家用途首次進(jìn)入市場(chǎng)時(shí)間國家/地區(qū)1977日本治療巨人癥1978美國治療糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH)1979美國治療侏儒癥1985美國人α干擾素（α－IFN)1980美國治療病毒感染癥1985美國乙肝疫苗1983美國預(yù)防乙型肝炎1986歐洲人白細(xì)胞介素－21984日本治療腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素治療貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子治療中性白細(xì)胞減少癥1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA)治療血栓癥1987美國第3頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程第4頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA重組藥物制造的主要步驟獲得目的基因DNA的體外重組（切與連）載體的選擇受體細(xì)胞的選擇重組DNA分子轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定（選）外源基因的大規(guī)模表達(dá)和分離純化產(chǎn)品的檢驗(yàn)和制劑制備第5頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程制藥過程上游部分下游部分第6頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月上游主要程序目的基因的獲得和克隆重組載體的構(gòu)建重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞外源基因在宿中細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)第7頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月下游主要程序工程菌的發(fā)酵目的蛋白的分離純化逐步加工成藥品

第9頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)基因工程基本原理第11頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月一、常用工具酶限制性內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶第12頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性內(nèi)切酶

內(nèi)切酶有I、II、III型三種類型，基因工程用II型內(nèi)切酶II型內(nèi)切酶其特點(diǎn)有：能專一性地識(shí)別特異性的序列，如BamHI，識(shí)別特異序列G^GATCC；識(shí)別序列一般都有回文結(jié)構(gòu)；切割后的DNA序列是平末端或粘末端第13頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第16頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶

DNA連接酶可以在體外將不同來源的DNA片段，連接起來成為新的雜種DNA分子，常用的連接酶有T4噬菌體連接酶和大腸桿菌連接酶第17頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶

DNA聚合酶是能催化DNA復(fù)制和DNA分子損傷的酶類，基因工程中常用的聚合酶是耐熱的聚合酶，如Taq酶，此酶最佳的活性溫度是75－80℃第19頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月逆轉(zhuǎn)錄酶

是依賴于RNA為模板的DNA聚合酶，同時(shí)有RNA酶H的活性常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有鼠源的和禽源的兩種第20頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月二、PCR技術(shù)PCR反應(yīng)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，常用的PCR技術(shù)是普通的PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR第21頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)第22頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月三、常用的載體克隆載體表達(dá)載體第23頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)常用表達(dá)系統(tǒng)第24頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)有自主復(fù)制起點(diǎn)篩選標(biāo)記啟動(dòng)子，能被RNA聚合酶識(shí)別終止子翻譯起始信號(hào)多克隆位點(diǎn)第25頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月pBV220系統(tǒng)pET系統(tǒng)第26頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月pBV220質(zhì)粒菌株DH10BJM109DH5α第27頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月pET質(zhì)粒菌株BL21DE3第28頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月二、酵母表達(dá)系統(tǒng)原核復(fù)制起始位點(diǎn)原核篩選標(biāo)記及其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)元件，包括啟動(dòng)子、終止子、翻譯起始信號(hào)多克隆位點(diǎn)真核轉(zhuǎn)錄和表達(dá)元件，包括啟動(dòng)子、終止字、翻譯起始信號(hào)真核復(fù)制起始位點(diǎn)或整合位點(diǎn)真核篩選標(biāo)記第29頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月

啤酒酵母表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng)漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)第30頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月Invitrogen公司的pYES2質(zhì)粒，含2μ復(fù)制序列和pUC復(fù)制起點(diǎn)，Amp和Ura篩選標(biāo)記，GAL1啟動(dòng)子和CYC2終止子pPIC9K全長9.3Kb，原核有氨芐和卡那抗性，真核中是組氨酸和HG418篩選標(biāo)記，有和染色體重組的整合位點(diǎn)，在多克隆位點(diǎn)的上游有信號(hào)肽序列，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)第31頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月pYES2半乳糖激酶啟動(dòng)子第32頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月pPIC9K甲醇氧化酶啟動(dòng)子目前已發(fā)現(xiàn)的、最強(qiáng)的真核啟動(dòng)子

第33頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)基因工程制藥上游技術(shù)第34頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月一、目的基因的獲得1.化學(xué)合成法在核酸合成以上可以自動(dòng)合成一條單鏈的寡聚核苷酸，準(zhǔn)確率比較高，但是費(fèi)用也高稍微長一點(diǎn)的基因，可以用互為引物PCR方法獲得再長一點(diǎn)的基因，可以用幾個(gè)粘末端的雙鏈片段通過連接酶連接組裝而成第35頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月2.PCR法如果知道基因序列，且基因沒有內(nèi)含子，就可以通過合成引物，通過PCR的方法人工合成基因3.逆轉(zhuǎn)錄法對(duì)有內(nèi)含子的基因常采用的方法，具體工程為：提取細(xì)胞或組織的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶和OligodT合成cDNA的第一鏈，再通過PCR方法合成第二連第36頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月二、目的基因的克隆

一般是將目的基因連接到T載體上，但有時(shí)候這一步可以省略

第37頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月三、基因的體外重組

雙酶切T載體和表達(dá)載體，體外連接

第38頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月四、重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到宿主菌中

體外連接的產(chǎn)物，用合適的方法轉(zhuǎn)入到宿主菌中，如用氯化鈣或電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，酵母的轉(zhuǎn)化還要經(jīng)歷大腸桿菌階段第39頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月五、外源基因的表達(dá)

根據(jù)啟動(dòng)子的類型，采用不同的表達(dá)條件，如pET系統(tǒng)，用IPTG或乳糖誘導(dǎo)，pBV220系統(tǒng)采用溫度誘導(dǎo)，畢赤酵母用甲醇誘導(dǎo)

第40頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月六、目的蛋白的檢測(cè)

一般采用活性試驗(yàn)和/或電泳菌體總蛋白質(zhì)第41頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)

基因工程制藥上游過程實(shí)例

第44頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)例一

三段引物，PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物連接到T載體上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T載體雙酶切

表達(dá)載體雙酶切體外連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)電泳檢測(cè)蛋白第45頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)例二

兩段引物，PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物連接到T載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌T載體雙酶切

表達(dá)載體雙酶切體外連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中活性檢測(cè)第46頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)例三

鯊魚肝總RNAOligodT逆轉(zhuǎn)錄第一鏈鯊肝活性肽N端序列，OligodTcDNA雙鏈連接到T載體上雙酶切 T載體和表達(dá)載體體外連接兩個(gè)片段轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中測(cè)序，與多肽序列對(duì)照誘導(dǎo)表達(dá)電泳檢測(cè)分子量，活性試驗(yàn)第47頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第六節(jié)工程菌的穩(wěn)定性

第48頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月工程菌的不穩(wěn)定性大多數(shù)是由于質(zhì)粒不穩(wěn)定造成的第49頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月一、工程菌的穩(wěn)定性質(zhì)粒分裂的不穩(wěn)定:工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定:指外源基因從質(zhì)粒上丟失或者堿基重排、缺失而導(dǎo)致的工程菌性能的改變

第50頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月1.質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒菌的比率兩種菌的比生長速度差異的大小插入的外源基因影響了質(zhì)粒穩(wěn)定區(qū)的結(jié)構(gòu)第51頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月2.提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法兩階段培養(yǎng)法發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化選擇合適的宿主菌或質(zhì)粒增大選擇壓力固定化技術(shù)第52頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月兩階段培養(yǎng)法菌體生長的一定階段的時(shí)候，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)大腸桿菌的pET系統(tǒng)畢赤酵母第53頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化通過適當(dāng)發(fā)酵工藝，可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以間隙改變發(fā)酵的環(huán)境參數(shù)，如溫度、溶氧量、酸堿度等第54頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇合適的宿主菌或質(zhì)粒根據(jù)表達(dá)蛋白的性質(zhì)，選擇合適的宿主菌和質(zhì)粒搭配pET系統(tǒng)中的宿主菌有BL21、DE3、DH10B等，質(zhì)粒有pET－3、5、12、14、、17、21、22、25、28、32、34、40等相對(duì)而言，Kan抗性的質(zhì)粒一般比Amp抗性穩(wěn)定裂殖酵母的nmt1啟動(dòng)子，有三種不同的強(qiáng)度第55頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月增大選擇壓力Amp的工作濃度一般在50μg/ml，發(fā)酵培養(yǎng)是可以加大到200μg/ml第56頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月固定化技術(shù)將細(xì)胞固定在載體上進(jìn)行培養(yǎng)第57頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第七節(jié)

重組蛋白高表達(dá)策略

第58頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

1.外源基因的拷貝數(shù)2.外源基因的表達(dá)效率3.表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性4.細(xì)胞的代謝負(fù)荷5.發(fā)酵條件的優(yōu)化第59頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月外源基因的拷貝數(shù)一般情況下，菌體內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)越多，外源基因就越多，轉(zhuǎn)錄的RNA也就越多，翻譯出來的蛋白也就越多第60頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月外源基因的表達(dá)效率

就目前人們的認(rèn)識(shí)水平，許多因素影響外源基因的表達(dá)效率啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列起始密碼子ATG的距離密碼子的組成第61頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

外源基因在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌而言，是異物，所以大腸桿菌體內(nèi)常會(huì)產(chǎn)生一些蛋白，消化表達(dá)產(chǎn)物，采用融合表達(dá)，分泌表達(dá)，點(diǎn)突變（改變外源蛋白的酶切識(shí)別位點(diǎn)），選用蛋白酶缺陷型的宿主菌第62頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞的代謝負(fù)荷

大量復(fù)制質(zhì)粒和表達(dá)外源基因，會(huì)破壞宿主菌原有的代謝平衡減輕細(xì)胞代謝負(fù)荷的一個(gè)方法是菌體的生長和表達(dá)外源基因分為兩個(gè)階段第63頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)酵條件的優(yōu)化

第64頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月二、酵母表達(dá)系統(tǒng)

1.外源基因的拷貝數(shù)相對(duì)于大腸桿菌，酵母的質(zhì)粒要少得多，而整合型的質(zhì)粒，如畢赤酵母，由于拷貝數(shù)可以比較高，所以現(xiàn)在用地非常普遍2.外源基因的表達(dá)效率1）啟動(dòng)子2）分泌信號(hào)的效率3）終止序列的影響4）偏好密碼子的使用第65頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月3.外源蛋白的糖基化4.宿主菌的選擇1）生長力強(qiáng)2）內(nèi)源蛋白酶活性弱3）菌株性能穩(wěn)定4）分泌能力強(qiáng)第66頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月5.發(fā)酵條件的優(yōu)化第67頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第八節(jié)重組蛋白的復(fù)性策略

第68頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月包含體（包涵體）：又稱光折射體，大腸桿菌高量表達(dá)外源基因時(shí)，大量的表達(dá)產(chǎn)物和DNA碎片、RNA、核糖體等結(jié)合在一起形成的一種顆粒包含體中的蛋白質(zhì)一般是不正確折疊的蛋白，特別是二硫鍵的錯(cuò)配第69頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月

高效表達(dá)的目的蛋白在大腸桿菌內(nèi)形成大量無活性包含體。

因無法有效的解決復(fù)性問題，在美國每年造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)幾十億美元包含體電鏡圖第70頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月一、減少包含體的策略

溫度分泌表達(dá)選用合適的宿主菌和載體稀有密碼子第71頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月二、包含體的復(fù)性

包含體是不溶性物質(zhì)，其中的蛋白質(zhì)復(fù)性一般過程是：用鹽酸胍、去污劑（Triton）等處理，是蛋白變成完全隨機(jī)的結(jié)構(gòu)形式，然后除去變性劑，再重新折疊成結(jié)構(gòu)活性的蛋白第72頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月包含體復(fù)性方法

溶液中復(fù)性反膠束環(huán)境復(fù)性分子伴侶固相復(fù)性第73頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月二硫鍵形成的方法

空氣氧化巰基化合物二硫鍵異構(gòu)酶混合二硫鍵交換法第74頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第九節(jié)

分離純化實(shí)例

第75頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月1.重組類人膠原蛋白

第76頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月膠原是結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)蛋白膠原蛋白是在提取膠原時(shí)，結(jié)構(gòu)沒有改變的一類蛋白羥脯氨酸

第77頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第78頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月重組類人膠原蛋白是通過逆轉(zhuǎn)錄在人體中釣取基因后，進(jìn)行了某些位點(diǎn)的突變，并在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白分子量70，000方法：親和層析純化

第79頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)酵后的工程菌，5000r/min離心30分鐘質(zhì)液比1：6將菌體懸浮于細(xì)胞破碎緩沖液中（1mmol/LEDTA,5mmol/LTris）冰水浴中超聲波破碎儀間斷超聲十次，每次90秒第80頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月破碎液于4℃，5000r/min離心1小時(shí)，收集上清液第81頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第82頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月上清液用硫酸銨分級(jí)沉淀收集15%~65%飽和度的蛋白質(zhì)沉淀第83頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月沉淀溶解在緩沖溶液中（20mmol/LTris-HCl，pH8.0）截流分子量30，000的超濾膜脫鹽濃縮第84頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第85頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月脫鹽的樣品和平衡緩沖液（1mmol/LNaCl）1：1混合層析柱用鋅離子充分螯合，并用10倍體積的平衡緩沖液平衡第86頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第87頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第88頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第89頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月上樣后，平衡液沖洗，掛柱100mmol/L的NH4Cl洗脫第90頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第91頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月2.重組白介素11第92頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月人IL-11蛋白由178個(gè)氨基酸組成，分子量是19144促血小板生長因子，可直接刺激骨髓造血干細(xì)胞和巨核祖細(xì)胞的增殖用于實(shí)體瘤和白血病放、化療后血小板減少癥的預(yù)防和治療及其它原因引起的血小板減少癥的治療大腸桿菌表達(dá)第93頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月誘導(dǎo)表達(dá)4℃，3000r/min離心10分鐘收集上清液孔徑5000的超濾膜超濾20mmol/LTris-HCl，pH8.0緩沖液洗滌脫鹽第94頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月20mmol/LTris-HCl，pH8.0緩沖液平衡陽離子交換拄上樣，NaCl梯度洗脫收集目標(biāo)峰加固體硫酸銨至2mol/L上樣疏水凝膠柱第95頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第96頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月2~0mol/L的硫酸銨梯度洗脫5mmol/L磷酸平衡G25上樣脫鹽第97頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第98頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月冷凍干燥第99頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月第十節(jié)

基因工程藥物介紹

第100頁，課件共106頁，創(chuàng)作于2023年2月一、重組胰島素

胰島素的作用是降低血糖濃度，達(dá)到治療糖尿病的目的胰島素是制劑,不良反應(yīng),豬胰島素1982年開始，美國等批準(zhǔn)用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的人源化胰島素三種