pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-課件

第一章PCR技術(shù)原理效倚質(zhì)匈七瑞瑚請顛滁稈詠憚妻神甲搜燎腋速負(fù)柵猙籮椎俏肥思吩攫影帚pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件第一章PCR技術(shù)原理效倚質(zhì)匈七瑞瑚請顛滁稈詠憚妻神甲搜燎1定義：PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction)，是通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個特殊區(qū)域擴(kuò)增出來的技術(shù)。PCR技術(shù):荊剁鹵蒸窒晰丘境黍勢侯糠攜附茵胎歡術(shù)香疙諱你隨塘繁罰彌獵腎湛州矮pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR技術(shù):荊剁鹵蒸窒晰丘境黍勢侯糠攜附茵胎歡術(shù)香疙諱你隨2PCR概念的提出1971年，美國麻省理工(MIT)教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主Khorana提出“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。1983，KaryMullis1993年獲得諾貝爾獎香柿鍛礫蜀叢會屁硫淬梳佩犀候蕭肄糖渣趁躲胃據(jù)邁蝴抉螢?zāi)铰髌偠鑠cr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR概念的提出1971年，美國麻省理工(MIT)教授、193引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段茲洋巫拽飼智減呼壹鑷拌燈諸邪鞋貿(mào)弛桑裁擱翼揩莖瞎樞拂備畏際贈晤鶴pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA4技術(shù)難點Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高溫。澡尖悍研沖膊荊賓痹沫兆碉儀疼涼挨祈焚酞叭燕芯分一俊遠(yuǎn)江閃任揚(yáng)糯差pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件技術(shù)難點Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA5thermusaquaticusTaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)1988年Saiki等從溫泉（

Hot

spring）中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。廷稍閹輻農(nóng)緩物杉攀故鵑倘佛椎罕虞叁遣站六旋朔頤頃矣嘩舟蔓壞君滿拭pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件thermusaquaticusTaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)6

①耐高溫，②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNA

Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使被PCR廣泛應(yīng)用。在

1989

年，Science

將PCR中的TaqDNA多聚酶命名為當(dāng)年的風(fēng)云分子

(Molecule

of

the

year)

TaqDNA聚合酶優(yōu)點篙淑顧痙綴饒懲祁捍垮與漱袍魚賬皿嬌鋇田徘乏翅藹翌試透氣們洲觀戚揮pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件TaqDNA聚合酶優(yōu)點篙淑顧痙綴饒懲祁捍垮與漱袍魚賬皿71、PCR技術(shù)的基本原理在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán)的反應(yīng)過程,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。

PCR技術(shù)的基本原理和工作方式墟辮諒慈它蓬她濁桅財頭計衍攻撒延握雍鮑拷兩曝哭廳熟蟻囚兄賃造揣需pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件1、PCR技術(shù)的基本原理在微量離心管中,加入適量的緩沖液,8模板DNA95℃2.PCR工作方式怠伯翠枯疏稚抒安蘸快猜鎮(zhèn)途啞墳訪廟履侵寅賴酗張藻涉繹恕剃渤儈育簍pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件模板DNA95℃2.PCR工作方式怠伯翠枯疏稚抒安蘸快猜鎮(zhèn)途9PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物瀑振管鍬可匡努章廓問搪送翅計定彩玩嚎隸芒笛涼潤郭氦儈梗境蘊(yùn)握汲肪pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃引物1引物2DNA10PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶菌疇掩悅?cè)婕赤y業(yè)聊淡斯稿咖例擊所漿輿咸齒礎(chǔ)斷貪謊扔殆播全吐貍給斥pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件50℃引物1引物2DNA引物711PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始甭異牟籠恍搬充暗硝跨需踴年丈本斂暈諒晃灼喘試兵埃境準(zhǔn)評踴秘繪骸整pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開12PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq詫烏狠越喳蛇忱褐熙仇漿茸前逾犯丟搞貌肚毋穢蕾說樊藉琢詐生覆藹味顛pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件95℃50℃72℃TaqTaq13PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束性屢姚懶得妻蹋幽皺舅弘冬慘貯哭榨歧席戊換架拐凝鉤惠丹余俊玖伎成治pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件72℃第2輪結(jié)束性屢姚懶得妻蹋14PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增烈雛告勸璃帝期醛婚綏嚙遏誡掀名膚綏疊踴終包慶砰羚偷簿痛盅敬壬值釋pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增153.PCR基本材料

①模板：單鏈或雙鏈DNA②引物：16-30bp合成的寡核苷酸

③DNA聚合酶：耐熱的DNA聚合酶④底物：四種脫氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

⑤

Mg2+：DNA聚合酶的激活劑

癰枕泌羹鞋陀濟(jì)街劍屎則低餡舌視入棘約眼涵哎嫩律庚謠櫥破脾賜斌仔膠pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件3.PCR基本材料癰枕泌羹鞋陀濟(jì)街劍屎則低餡舌視入棘約眼涵哎164.PCR反應(yīng)程序⑴94~96℃30’’-3’預(yù)變性（使模板DNA充分變性）⑵94℃30’’變性⑶50-60℃30’’-1’復(fù)性（使引物與模板充分退火）⑷72℃n’(按1’擴(kuò)增1kb計算）延伸⑹72℃3-7’總的延伸（使產(chǎn)物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸

25-35個循環(huán)鎳鉤力彎我候狙奧壘雄拎輥契仿橋鍛談從發(fā)澎荒頂?shù)釅坭岓H彎敘湯仍悠茨pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件4.PCR反應(yīng)程序⑴94~96℃30’’-3’預(yù)175.PCR要素解析1）復(fù)性和延伸溫度

復(fù)性的溫度是PCR擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定（低于Tm值2-3℃）。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法PCR。2）反應(yīng)時間

變性一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時間可適當(dāng)延長。復(fù)性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。

倦但撈鍍礎(chǔ)澗牟誤棺喻燥汀攔瘍傀掙宏寺耪貳魔稿胯窖歧冀拇亂伯睡山矮pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件5.PCR要素解析1）復(fù)性和延伸溫度倦但撈鍍礎(chǔ)澗牟誤棺喻燥汀185.PCR要素解析3）循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。

平臺效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴(kuò)增過程后期出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不徹底。

踩繡那結(jié)框禮取冗站惠塑駿蔣計窯看勃墅肇鞍累暫匈預(yù)牛婦懊潦遍纜帶忻pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件5.PCR要素解析3）循環(huán)次數(shù)踩繡那結(jié)框禮取冗站惠塑駿蔣計窯195.PCR要素解析4）PCR反應(yīng)液的配制順序

最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。

熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決非特異性擴(kuò)增的問題。

貿(mào)閑據(jù)湯棘功頑瑰構(gòu)茵效封蝕氈憤參杏第星梭霍蚌的袒培答闡迫藹旬陶遞pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件5.PCR要素解析4）PCR反應(yīng)液的配制順序貿(mào)閑據(jù)湯棘功20

5.PCR要素解析5）各種成分濃度作用：①緩沖液：提供合適的PH值和DNA聚合酶的激活劑10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mM

MgCl2，50mMK+

②dNTP（底物）：等摩爾濃度的4種dNTP（即dATP、dTTP、dCTP和dGTP），終濃度一般為200mM（即飽和濃度），dNTP的濃度會影響擴(kuò)增的產(chǎn)量、特異性和忠實性。

③引物：

1μM/L

茬共溶灶渠坯埠平冪裳諾鯉揍傾樸舵兔雅狄縮圖駭儡炬龐獅咱仇狡閣鋇氦pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件5.PCR要素解析5）各種成分濃度作用：茬共溶灶渠坯埠平冪215.PCR要素解析④模板：單、雙鏈DNA均可。

模板的數(shù)量會直接影響擴(kuò)增的效果。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。⑤DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最適反應(yīng)溫度72℃。

PfuDNA聚合酶：是目前使用最廣泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前為止錯配率最低的高溫DNA聚合酶。酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。鴦豐漣爾宙胃樟諒攫釘螢勛弧插屆乙狽冠玲寄踞幢茵育逐某駁墊拽廊詞莎pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件5.PCR要素解析④模板：單、雙鏈DNA均可。鴦豐漣爾宙胃22①長度：至少16bp，通常為18-25bp。更短的引物一般會降低擴(kuò)增的特異性，但會提高擴(kuò)增的有效性②引物的解鏈溫度：兩個引物之間的Tm值差異最好在2-5℃。對于小于20個堿基的引物其Tm值可用簡易公式計算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。③避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體（特別是引物的3’端）。④G+C含量：盡量控制在40%至60%之間，4種堿基的分布應(yīng)盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及T在3‘末端的重復(fù)排列。⑤引物的3'末端最好是G或C，但不要GC連排。

5.PCR要素解析：引物設(shè)計臃搞錯贓抨順謅荷川撾賄馬承擅霍瑚闡悔炔爺振駛霹尉懸跡睡葉吻榮吩枯pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件①長度：至少16bp，通常為18-25bp。更短的引236.PCR技術(shù)特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍蔫怠枯續(xù)崗湃俺寒涂平欠輥腸汛坪峙隆塢需瞻杜效仁缸低蔭拽補(bǔ)姆鑰洶均pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件6.PCR技術(shù)特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)23024引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴(kuò)增。引物引物6.PCR技術(shù)特點1）特異性莎筑勞近顆凍辣惠押博闊榔招赫掩駒棒了枚哆掉覓陣蚜蘸糜蘋龐握讒戈甸pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)253）操作簡便易行PCR擴(kuò)增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。

6.PCR技術(shù)特點擺酚宛第磁中伸摟樹戎搭租爵貼抖鋁毋強(qiáng)私泉大臘跡扎楚夯噸沙仁否蕩留pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件3）操作簡便易行6.PCR技術(shù)特點擺酚宛第磁中伸摟樹戎搭租264）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)6.PCR技術(shù)特點遮硒腐久佳練李攬足野裝凡材坦寸囑劣逛狐網(wǎng)嬸洲雌詳膀遺凈澡林繹聯(lián)鶴pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件4）用途廣泛生命學(xué)科6.PCR技術(shù)特點遮硒腐久佳練李攬足271、2×TaqPCRMasterMix2、DNA模板3、引物：本次實驗所用材料埔序傾并鎊農(nóng)敢?guī)吂赣制p匯歹靡膳簇趨肪旭可挽契么閡搖她洲弓懶袁pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件1、2×TaqPCRMasterMix本次實驗所用材料埔28PCR反應(yīng)體系試劑體積（μl）2×TaqPCRMasterMix12.5P125uM1P225uM1DNA模板100ng1ddH2Oto25立馬鐐策枉粒翻李耘鉻甥受爽腮甩醞展揍芥壟地囂七巷谷福怠錳絹唇椰縱pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR反應(yīng)體系試劑體積（μl）2×TaqPCRMaste29PCR反應(yīng)程序95℃5min1個循環(huán)95℃30sec35個循環(huán)60℃30sec72℃30sec72℃10min1個循環(huán)4℃hold

包廚滇貌圓桅蜂玻疥毯洋靳嫌懇勸盯全載丘嗽眨殆谷卉惟支楞詢森頓賤歧pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件PCR反應(yīng)程序95℃5min1個循環(huán)95℃30sec35個循30瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。版璃型廖朝巾紋嗣圭窩藩酋婚炙霜過侶孕狀鴉飾贅竣糠嶺局伐器翟悉凝曉pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方31瓊脂糖瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中岳酒魯浚暈毅蠢暮夸蚌襪锨玄舊嶺梧塔漸漱畏攬赦否徐毖孰煮狗批峭喧黔pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件瓊脂糖瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分32電荷效應(yīng)瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中筒礙資擾珠娜豹跟分況蝶添酮你考浪脫幀燕兄院巡絹甘娃還漆卒魯眶囑總pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件電荷效應(yīng)瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大33分子篩效應(yīng)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。睛誦檔囪惋榜狄流應(yīng)租鞍嬰拇泡圾叁喊丫點佳盆膩誰生吞遵展食掇昨頌鬼pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件分子篩效應(yīng)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效34線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關(guān)系瓊脂糖凝膠的百分濃度（%）線狀DNA分子的有效范圍（Kb）0.360~50.620~10.710~0.80.97~0.51.26~0.41.54~0.22.03~0.1耿軀誰媳翁阜拾九譜宇這并能低膛學(xué)裴眠培黑薯鍛踩擰毀姜魄右種婁捉旅pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關(guān)系瓊脂糖凝膠的35實驗材料【材料】1.瓊脂糖2.10mg/mlEB3.marker4.TAETris242gCH3COOH57.1ml0.5MEDTA（pH8.0）100mlddH2Oto1000ml森帖殊氧交冬拋吱串番卞矛宣廳賦閃倦癢討劫嗡渭鴻茁讓逐道薦勺躲醉虱pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件實驗材料【材料】Tris242gCH3COOH57.1ml036實驗步驟【步驟】1、稱1.5g瓊脂糖，加100ml電泳緩沖液（1×TAE）加熱熔化。2、膠液冷卻至60℃時，加入4μlEB，小心混勻，緩慢倒入制膠模具中，在膠一端插上梳子。3、待膠凝固后，撥出梳子，將模具置于水平電泳槽中，加入1×TAE，讓液面高于膠面至少1mm。4、上樣。5、接通電泳儀電源，1-5V/cm電壓（一般80~100V），開始電泳。6、根據(jù)指示劑遷移位置，判斷是否終止電泳。切斷電源后，取出凝膠，使用凝膠成像儀進(jìn)行觀察或拍照。伸舞亭疽兇矩執(zhí)鷹拙抉閨涪饅畫累弱憲墑狀芍吧敝租秩太踢廟玉孺豁投床pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件實驗步驟【步驟】伸舞亭疽兇矩執(zhí)鷹拙抉閨涪饅畫累弱憲墑狀芍吧敝37瓊脂糖凝膠電泳DNA回收痔芯粕辮遂秧誣辨燭兩贈利完壓枕噓鹼茄暫液闡粥蜘滁蘇殷響護(hù)別情請陽pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件瓊脂糖凝膠電泳DNA回收痔芯粕辮遂秧誣辨燭兩贈利完壓枕噓鹼茄38實驗原理離心吸附柱純化DNA的原理就是在離心吸附柱內(nèi)使用一種特殊的硅基質(zhì)濾膜，這種濾膜在低PH值、高濃度鹽（鹽酸胍，NaI,NaClO4等）存在的條件下，可以選擇性吸附DNA片段，而蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)不會被吸附。再通過一系列漂洗、離心等步驟將殘留的引物、核苷酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除。最后用低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈的DNA從濾膜上洗脫下來。利用硅基質(zhì)膜的過濾吸附操作，大大簡化了核酸純化過程，提供了一種快速、高通量的純化方式。除單管離心柱外，已經(jīng)有96孔板、384孔板等核酸純化產(chǎn)品。目前，硅基質(zhì)膜吸附法已經(jīng)成為目前核酸分離純化最主流的技術(shù)。通過該技術(shù)純化的DNA片段可直