分子生物學(xué)分子雜交技術(shù)課件

分子雜交及生物芯片技術(shù)申川軍廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室分子雜交及生物芯片技術(shù)申川軍參考書屈伸劉志國參考書屈伸劉志國2目錄

第一章生物大分子制備和分析常用技術(shù)

第二章蛋白質(zhì)、核酸的提取與分離

第三章PCR技術(shù)

第四章分子雜交與印跡技術(shù)

第五章分子克隆技術(shù)

第六章外源基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

第七章蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)

第八章分子標(biāo)技術(shù)

第九章分子改造技術(shù)

第十章測序及人工合成技術(shù)

第十一章基因組學(xué)技術(shù)

第十二章蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

第十三章生物芯片技術(shù)

第十四章生物信息學(xué)技術(shù)

目錄

3參考書馬文麗

鄭文嶺

彭翼飛

參考書馬文麗

鄭文嶺

彭翼飛

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目錄第一章核酸的分子結(jié)構(gòu)與分子雜交的基本原理第二章核酸分子雜交的類型第一節(jié)固相核酸分子雜交類型一、菌落原位雜交（colonyinsituhybridization）二、斑點(diǎn)雜交（dotblot）三、southern印跡雜交（southernblot）四、northern印跡雜交（northernblot）五、組織原位雜交（tissueinsituhybridization）第三章核酸探針的種類、標(biāo)記及檢測第一節(jié)核酸探針的種類dna探針cdna探針rna探針寡核苷酸探針第二節(jié)核酸探針的標(biāo)記和檢測放射性同位素非放射性核酸探針第四章核酸分子雜交實(shí)驗因素的優(yōu)化探針選擇標(biāo)記方法濃度雜交率雜交最適溫度雜交的嚴(yán)格性反應(yīng)時間雜交促進(jìn)劑第五章斑點(diǎn)雜交

5第六章southern印跡雜交第一節(jié)southern印跡雜交的基本原理一、dna從凝膠到膜上的轉(zhuǎn)移方法二、southern雜交膜三、核酸探針的標(biāo)記第二節(jié)southern印跡法的基本過程一、dna樣品的酶切和電泳二、準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)移的凝膠三、dna從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物四、探針標(biāo)記五、雜交六、洗膜七、雜交結(jié)果的檢測八、雜交膜的重復(fù)使用九、注意事項十、雜交嚴(yán)謹(jǐn)性第七章northern印跡雜交第八章原位雜交第九章菌落原位雜交第十章dna芯片技術(shù)第六章southern印跡雜交6基本概念變性/復(fù)性：分子雜交：異源互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程稱為分子雜交。分子雜交技術(shù)：凝膠電泳分離待測DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移固定到支持物或結(jié)合物上，然后與探針/抗體雜交分析。探針(Probe)：已知序列的標(biāo)記單鏈核酸片斷，用于檢測與其互補(bǔ)的待測核酸。基本概念變性/復(fù)性：7BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).Basepairingoccursinduplex8基本概念原位雜交（Insituhybridization,ISH）：菌落原位雜交(ColonyISH)組織原位雜交(TissueISH)：胚胎原位雜交(EmbryoISH)：斑點(diǎn)/狹縫雜交(Dot/slotblot)：基本概念原位雜交（Insituhybridization9基本概念Bio-chip（生物芯片）DNAchip/microarrayGenechip/microarrayOligonucleotidemicroarraycDNAchipProteinchipmicroRNAchipLab-on-chip（芯片實(shí)驗室）基本概念Bio-chip（生物芯片）10分子生物學(xué)分子雜交技術(shù)課件11分子生物學(xué)分子雜交技術(shù)課件12分子雜交技術(shù)生物大分子的印跡雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)生物大分子的印跡雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)定義：凝膠電泳分離待測DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移固定到結(jié)合物上，然后與探針/抗體雜交分析原理：核酸變復(fù)性（序列互補(bǔ)）/抗原-抗體基本工藝：凝膠電泳（原位處理）樣品轉(zhuǎn)移及固定雜交分析（免疫結(jié)合分析）分子雜交技術(shù)定義：凝膠電泳分離待測DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移14分子雜交技術(shù)1969，Insituhybridization（ISH）1975，Southern，Southernblot:DNA1977，Alwine，Northernblot：RNA1979，Towbin，Westernblot：Pr1982，Reinher，Easternblot：Pr(IEF)分子雜交技術(shù)1969，Insituhybridizat15分子雜交技術(shù)探針探針基本條件（特點(diǎn)）標(biāo)記物（32p,35S,125I,Digoxigenin,FITC）單鏈核酸（ssDNA，sscDNA(更常用)）高特異性（~500bp）標(biāo)記物穩(wěn)定靈敏，檢測方便安全分子雜交技術(shù)探針探針基本條件（特點(diǎn)）16分子雜交技術(shù)探針探針的種類DNAprobe（基因copy數(shù)、病原基因診斷）cDNAprobe（基因表達(dá)等最常用）RNAprobe（ISH）Oligonuleotide-probe（25~50bp；基因診斷，SNP分析、測序、點(diǎn)突變檢測）分子雜交技術(shù)探針探針的種類17分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記物放射性標(biāo)記物（[α-*N]-dNTP）32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)非放射性標(biāo)記物半抗原：生物素、地高辛熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記物18分子雜交技術(shù)探針-32P-dNTP結(jié)構(gòu)A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHOOOHHHHOCH2分子雜交技術(shù)探針-32P-dNTP結(jié)構(gòu)A、G、19分子雜交技術(shù)探針分子雜交技術(shù)探針20分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記隨機(jī)引物法缺口平移法(DNaseIandDNA聚合酶I)末端標(biāo)記法堿性磷酸酶-T4多核苷酸激酶[γ-32p]-ATP標(biāo)記DNA/RNA-5′末端轉(zhuǎn)移酶（poly(N*)n）T4DNA聚合酶/Klenow片斷（粘末端補(bǔ)平）分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記21分子雜交技術(shù)探針探針純化乙醇沉淀法凝膠過濾法（G-50Spincolumn）分子雜交技術(shù)探針探針純化22分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）支持物：硝酸纖維素膜（NC膜）尼龍膜N+-nylon（DNA/RNA）中性膜PVDF膜（westernblot）分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）支持物：23分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）方法：毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）方法：24分子雜交技術(shù)—印跡濕濾紙緩沖液濾紙橋凝膠硝酸纖維素膜吸水紙玻璃板支持臺容器重物毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法分子雜交技術(shù)—印跡濕濾紙緩沖液濾紙橋凝膠硝酸纖吸水紙玻璃板支25分子雜交技術(shù)—印跡尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極電轉(zhuǎn)移法分子雜交技術(shù)—印跡尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–26分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移法-1h分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移法-1h27分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移裝置分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移裝置28分子雜交技術(shù)—印跡Westernblot(SDS及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng))分子雜交技術(shù)—印跡Westernblot(SDS-PAG29分子雜交技術(shù)—影響因素離子強(qiáng)度(高-消除靜電斥力-利于雜交)溫度（低于Tm20-25℃）有機(jī)試劑（去離子甲酰胺）-降低Tm樣品/探針分子的大小和復(fù)雜程度洗滌條件（高嚴(yán)謹(jǐn)性，洗去非特異性結(jié)合探針）支持物添加物（吸附DNA探針，使DNA接觸面增大）分子雜交技術(shù)—影響因素離子強(qiáng)度(高-消除靜電斥力-利于雜交)30#預(yù)雜交

為減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)核酸的非特異性結(jié)合，雜交前用封閉物將這些非特異位點(diǎn)封閉。變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當(dāng)與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個背景覆蓋一層。由于它們與探針無同源性，在交雜反應(yīng)中可大大減少探針的非特異性結(jié)合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點(diǎn)的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。#預(yù)雜交為減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)31分子雜交技術(shù)—基本流程樣品及探針制備樣品電泳分離轉(zhuǎn)膜預(yù)雜交雜交洗膜分析（壓片、顯色、熒光觀察等）分子雜交技術(shù)—基本流程樣品及探針制備32分子雜交技術(shù)SouthernblotDNA提取酶切電泳/拍照轉(zhuǎn)膜/固定探針制備預(yù)雜交雜交洗膜掃磷屏分子雜交技術(shù)Southernblot33分子雜交技術(shù)UV交聯(lián)儀多用途254nm紫外輻射系統(tǒng)，主要用于將核酸交聯(lián)于膜上。還用于瓊脂凝膠中DNA的切割，RecA突變篩選，胸腺二聚體產(chǎn)生的部分限制性內(nèi)切酶消化，UV滅菌消除PCR污染。另紫外滅菌-聚合物紫外處理。分子雜交技術(shù)UV交聯(lián)儀多用途254nm紫34分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用DNA多態(tài)性分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD）基因突變檢測基因copy數(shù)檢測重組子篩選DNA指紋分析測序分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用35分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用DNA指紋分析血跡中的DNA分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用血跡中的DNA36分子雜交技術(shù)Northernblot基因表達(dá)分析mRNA長度及半定量分析RNA分子（TRIzol）甲醛變性電泳至膜上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用10xSSC轉(zhuǎn)移RNA吸附有RNA片段的膜（亞甲藍(lán)染色）帶有RNA片段的凝膠分子雜交技術(shù)NorthernblotRNA分子（TRIz37分子雜交技術(shù)Westernblot蛋白提取/樣品準(zhǔn)備SDS電轉(zhuǎn)/麗春紅S染色封閉一抗孵育洗滌一抗二抗孵育洗膜結(jié)果觀察/顯色（Dig-AP/FITC）組織蛋白分子雜交技術(shù)Westernblot組織蛋白38分子雜交技術(shù)ISH胚胎/組織制備固定消化/再固定/洗滌RNA探針制備封閉雜交/洗滌一抗/洗滌二抗/洗滌顯色(Dig-、FITC、Cy5)抗衰老基因Klotho原位雜交圖斑馬魚krox20基因原位雜交圖3,5菱腦節(jié)分子雜交技術(shù)ISH抗衰老基因Klotho原位雜交圖斑馬魚k39分子雜交技術(shù)FISH分子雜交技術(shù)FISH40生物芯片Biochip生物芯片Biochip生物芯片定義：在斑點(diǎn)雜交基礎(chǔ)上，模擬制備大規(guī)模集成電路的基本原理，集成了探針原位合成、照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦顯微技術(shù)發(fā)展來的一門分子生物學(xué)技術(shù)原理：將大量樣本固定于較小的支持物上，然后與標(biāo)記好的待測樣品雜交，再檢測雜交信號的強(qiáng)弱，從而判斷樣本中待測DNA、RNA、Pr等分子數(shù)量或活性狀態(tài)特點(diǎn)：高通量、微型化、集約化、標(biāo)準(zhǔn)化等生物芯片定義：在斑點(diǎn)雜交基礎(chǔ)上，模擬制備大規(guī)模集成電路的基本42生物芯片生物芯片43生物芯片種類微陣列芯片（基因芯片/蛋白芯片/細(xì)胞芯片等）微流控芯片（屬于主動式芯片，如樣品制備芯片、PCR芯片、毛細(xì)管電泳芯片和色譜芯片等）芯片實(shí)驗室（以生物芯片為基礎(chǔ)的集成化分析系統(tǒng);可完成如樣品制備、試劑輸送、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測、信息處理和傳遞等一系列復(fù)雜工作）生物芯片種類44生物芯片基本流程：芯片制備原位合成法原位光照蝕刻微量點(diǎn)樣法樣品制備（Sample-Cy3；Control-Cy5）分子雜交檢測分析（Confocus、CCD）生物芯片基本流程：45生物芯片原位光照蝕刻原理石英片氫化后封閉設(shè)計11um見方窗口遮罩對封閉部分光解將nt加入通過化學(xué)偶合連接到晶片上更換不同的遮罩進(jìn)行UV光解加入nt進(jìn)