分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)

分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)1第1頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)、重組DNA技術(shù)-基因工程第二節(jié)、分子雜交及相關(guān)技術(shù)第三節(jié)、聚合酶鏈反應(yīng)的原理和應(yīng)用第四節(jié)、基因定位的常用方法2第2頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分子生物學(xué)技術(shù)70年代以來,分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展起來,使人們有可能進(jìn)行人類基因組及單個(gè)基因的結(jié)構(gòu)研究,分析其功能特征,了解其變化規(guī)律。分子生物學(xué)技術(shù)為揭示人類遺傳病的本質(zhì)起著重要作用。下面就一些分子生物學(xué)技術(shù)予以介紹。3第3頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月194619501955196019651970197519801985199019951944DNA是遺傳物質(zhì)1949Hbs貧血1953雙螺旋1956HbsGlu-Val1966遺傳密碼第一個(gè)R酶1972重組質(zhì)粒1975DNA雜交1977DNA測(cè)序1981轉(zhuǎn)G小鼠1983HD病G定位1985PCR1986位置克隆1987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一個(gè)基因治療1995細(xì)菌G組序列1996酵母基因組序列現(xiàn)代分子遺傳學(xué)發(fā)展重要事件4第4頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

第一節(jié)重組DNA技術(shù)-基因工程

重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技術(shù)。重組DNA技術(shù)（RecombinantDNATechnique）是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。

5第5頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、限制酶

限制性內(nèi)切核酸酶(restrictiveendonucleases)，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（“分子手術(shù)刀”）。發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。6第6頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、限制酶的命名

根據(jù)其來源命名。如：

屬名菌株名

EcoRI

種名編號(hào)EcoRI來源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。7第7頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、限制酶識(shí)別序列和切割形成

每種限制酶能識(shí)別和切割的通常4～8個(gè)核苷酸序列，稱為限制性位點(diǎn)或切點(diǎn)。

如：HareⅢ5’-GGCC-3’

BamHI5’-GGATCC-3`

平末端(bluntend)對(duì)稱軸切，連接效果差切割形成粘性末端（stickyend）交錯(cuò)切。8第8頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9第9頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月部分常用限制酶及切點(diǎn)10第10頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月互補(bǔ)末端連接11第11頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)生相同序列的突出末端的不同片段

可有三種方式：

1)用同一種限制酶切割；2)用識(shí)別相同靶序列的不同限制酶切割；3)用識(shí)別不同靶序列但可產(chǎn)生一致的粘性末端的限制酶切割。12第12頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、特點(diǎn)：

根據(jù)上述限制酶的特點(diǎn)，在基因工程和基因診斷中的重要用途：1)不論DNA的來源如何，同一種限制酶切割后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因此可將不同種屬的DNA重組。如人和質(zhì)粒DNA等。2)用于人類基因組的DNA分析，具特定的酶切位點(diǎn)。3)Gene突變改變酶切位點(diǎn)的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片段長(zhǎng)度。應(yīng)用于限制性片段多態(tài)性分析。13第13頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、基因運(yùn)載體及其選擇

載體（Vector）:將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。14第14頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體具以下特征：1)分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中增殖；2)有多種限制酶切點(diǎn)，每種限制酶最好只有單一切點(diǎn)；3)被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力，并有可選擇的標(biāo)記基因（如，抗藥基因）。常用的載體有：質(zhì)粒，λ噬菌體，粘粒，BAC，YAC，PI等。15第15頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）.質(zhì)粒plasmid

Plasmid獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

PBR322

大腸桿菌

pSC101

Plasmidchromosome

COIEIplasmid革蘭氏陰性菌

pc194

scp12

真核生物-酵母質(zhì)粒

16第16頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常用的質(zhì)粒如pUC19，多連接子MCS。插入外源基因片段長(zhǎng)度約10kb。將外源基因插入到MCS中，隨質(zhì)粒的表達(dá)而表達(dá)，增殖而擴(kuò)增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性喪失而不顯蘭色-白色菌落。如果不插入外源基因，則產(chǎn)生蘭色。從而篩選陽(yáng)性菌落。

EcoRIHindIIIOri復(fù)制起點(diǎn)LacZAPRpUC1917第17頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（二）.λ-噬菌體(λphage)是一種可在體外包裝的細(xì)菌病毒,可高效感染大腸桿菌.λ-噬菌體DNA是線狀雙鏈DNA分子,全長(zhǎng)約50kb,每條鏈各帶12bp長(zhǎng)的單鏈互補(bǔ)末端-粘末端(COS序列)。進(jìn)入宿主細(xì)胞后不久，COS序列堿基配對(duì)環(huán)化。改建后的λ噬菌體發(fā)展了多種較大型的克隆載體，如：18第18頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、置換λ載體–

溶解途徑載體和外源DNA整合到宿主菌DNA中?？煽寺?3kb的外源DNA。2、插入λ載體–

裂解途徑

DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制，然后包裝成噬菌體，裂解宿主，釋放噬菌體?？煽寺?kb的cDNA。19第19頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月裂解途徑20第20頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）.粘粒(cosmidvector)

（30～40kb）

是將質(zhì)粒和λ噬菌體改建的一種載體.它含COS序列,插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和cos末端。全長(zhǎng)8kb。大片段外源DNA插入后，在體外包裝進(jìn)而被克隆?？砂b30～45kb長(zhǎng)的DNA片段，多用于基因文庫(kù)構(gòu)建。

21第21頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(四)大片段DNA克隆載體

人類和哺乳動(dòng)物的基因組很大，甚至許多單個(gè)基因也相當(dāng)大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來構(gòu)建的一些載體：BAC，PI，YAC等。22第22頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）

優(yōu)點(diǎn)：能攜帶大片段DNA，約300kb。在每個(gè)細(xì)胞中，一個(gè)載體分子能繁殖多個(gè)拷貝，高產(chǎn)DNA。缺點(diǎn)：會(huì)出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆DNA部分的缺失或重排。為克服上述缺點(diǎn)，人們采用低拷貝數(shù)復(fù)制子載體，如，Ecoli中的F因子。此質(zhì)粒含有2種基因（partA,partB）。每個(gè)Ecoli能接受>300kbDNA片段。23第23頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、噬菌體PI載體和PAC

PI噬菌體與λ噬菌體一樣，外有蛋白質(zhì)殼。內(nèi)含相當(dāng)大的（110～115kb）線性DNA，并在體外包裝于PI殼內(nèi)。PI進(jìn)入宿主細(xì)胞后環(huán)化，擴(kuò)增。1994年，有人將PI和F因子克隆結(jié)合產(chǎn)生PI人工染色體克隆系統(tǒng)-----PAC。24第24頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）適用于克隆大片段DNA，0.2～2Mb。25第25頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月YAC的主要功能成份有三：

1）著絲粒：mitosis姊妹染色單體和減I同源染色體分離之必需。2）端粒：保護(hù)染色體末端免受核酸酶的侵襲。3）自主復(fù)制序列（ARS）元件：是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。構(gòu)建YAC需要4個(gè)短序列：2個(gè)端粒，著絲粒，ARS元件，與外源DNA連接成線性DNA分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆。26第26頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、DNA重組與分子克隆化

為獲得所需的基因或特異序列，需從細(xì)胞中分離得到目的基因與載體DNA重組，并用適當(dāng)方法在宿主細(xì)胞中表達(dá)，擴(kuò)增得到大量相同的DNA片段，稱為DNA克隆，亦稱分子克隆。27第27頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

基本原理與過程：

1、分離純化目的基因

2、目的基因+vector=重組DNA分子

3、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在其內(nèi)增殖。

4、篩選含有重組DNA的細(xì)胞——細(xì)胞克?。╟ellclone），將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于瓊脂表面，以刺激細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，這些細(xì)胞是由單個(gè)細(xì)胞形成的遺傳相同的細(xì)胞群體，故稱細(xì)胞克隆。再將每個(gè)克隆移至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。

5、分離重組DNA克隆：即收獲擴(kuò)增的培養(yǎng)細(xì)胞，并選擇分離重組DNA。28第28頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分離純化目的基因

目的基因+vector=重組DNA分子

29第29頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月重組DNA和分子克隆

30第30頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月重組DNA和分子克隆的幾種方法：

（依目的基因的來源）

1、從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆

2、由特定mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再進(jìn)行克隆

3、化學(xué)合成目的基因進(jìn)行克隆

4、PCR體外擴(kuò)增目的片段進(jìn)行克隆31第31頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆

32第32頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月篩選含有重組DNA的細(xì)胞——細(xì)胞克隆（cellclone）

33第33頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月篩查含有目的基因的細(xì)胞克隆34第34頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、目的基因表達(dá)

上述細(xì)胞的克隆系統(tǒng)可直接導(dǎo)入的目基因擴(kuò)增，獲得足夠量的目的基因來進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的研究。重組DNA技術(shù)的另一目的是獲得基因重組后的產(chǎn)物——RNA，蛋白質(zhì)。就是將目的基因與表達(dá)載體重組，導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)出相應(yīng)的基因產(chǎn)物（蛋白）。如胰島素，干擾素；生產(chǎn)疫苗的抗原和特異的抗體等。此類克隆系統(tǒng)稱為表達(dá)克隆。（expressioncloning）.35第35頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目的基因表達(dá)

36第36頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）．真核細(xì)胞的基因在原核細(xì)胞

（細(xì)菌）中表達(dá)

原核細(xì)胞中缺乏真核基因表達(dá)裝置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表達(dá)。通常采用大腸桿菌為宿主。真核多肽的表達(dá)要求：

1）適當(dāng)?shù)腸DNA（完整的編碼序列）；

2）適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，提供特定多肽信息；

3）外部進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)有啟動(dòng)子。

產(chǎn)物特征：

1）真核細(xì)胞的蛋白由于不能羥基化而不穩(wěn)定；

2）活性受限或無活性。37第37頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(二)、真核細(xì)胞基因在真核細(xì)胞中表達(dá)

真核宿主細(xì)胞提供一個(gè)相似但又不相同的環(huán)境。常采用酵母或昆蟲細(xì)胞作為宿主。應(yīng)用于真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的大量制備，研究特定基因的表達(dá)。產(chǎn)物翻譯后羥基化，羧基化等，有加強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定和功能活性。38第38頁(yè)，課件共42頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月