基因個體化治療匯總課件

個體化藥學服務與基因相關概念個體化藥學服務與基因相關概念1人類基因組計劃1990年正式啟動人類基因組測序計劃,2003年完成。

識別人類基因組的所有大約3萬個DNA測定組成人類基因組DNA的約30億對核苷酸的序列人類基因組計劃1990年正式啟動人類基因組測序計劃,2002個體化用藥—主要潮流，大勢所趨WHO：2000年提出，21世紀步入“3P”時代—預防（preventive），預測（predictable)和個體化（personal）美國FDA：2006全美3600萬份用藥記錄中，880萬份（24.3%）使用了說明書中有基因組生物標記信息的藥物。FDA：2013.12，已經批準超過200個需要患者基因信息指導才能準確治療的藥物，涉及約40%的患者。三甲評審標準要求：進行個體化給藥方案的研究與監(jiān)測個體化用藥—主要潮流，大勢所趨WHO：2000年提出，21世3Wewouldn’tthinkofbuyingshoesinasinglesize

我們不會愿意買只有一個尺碼的皮鞋Sowhyshouldwebesatisfiedwithone-size-fits-allmedicine?那為什么我們就滿足于千人一方呢？Wewouldn’tthinkofbuyingsh4據世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，各國住院病人發(fā)生藥品不良反應的比率在10%至20%，其中5%的患者會因為嚴重的藥品不良反應而死亡。目前全世界死亡的病人中，約有1/3的患者死于用藥不當，藥品不良反應致死占社會人口死因的第4位。藥物毒性或不良反應的發(fā)生往往是因為藥物反應的個體差異所致；個體差異使藥品的效果差異顯著。個體化藥學服務的必要性據世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，各國住院病人發(fā)生藥品不良反應的比率5個體化藥學臨床應用的意義降低醫(yī)療事故發(fā)生率縮短平均住院日提高醫(yī)院收入為臨床用藥提供更精確的指導（精準劑量,減少不良反應，藥物相互作用等）個體化藥學臨床應用的意義降低醫(yī)療事故發(fā)生率6療效好療效不好或無療效毒副反應藥物反應的個體差異相同藥物治療的一組人群基因?環(huán)境?藥物不良反應藥物效應療效好療效不好或無療效毒副反應藥物反應的個體差異相同藥物治療7據世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，各國住院病人發(fā)生藥品不良反應的比率在10%至20%，其中5%的患者會因為嚴重的藥品不良反應而死亡。目前全世界死亡的病人中，約有1/3的患者死于用藥不當，藥品不良反應致死占社會人口死因的第4位。藥物毒性或不良反應的發(fā)生往往是因為藥物反應的個體差異所致；個體差異使藥品的效果差異顯著。個體化藥學服務的必要性據世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，各國住院病人發(fā)生藥品不良反應的比率8相關藥物的劑量范圍各類常用藥物的有效率常用藥物的有效率與劑量相關藥物的劑量范圍各類常用藥物的有效率常用藥物的有效率與劑量90%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%基因環(huán)境因素II糖尿病乳腺癌男性心肌梗死原發(fā)性高血壓病冠心病I糖尿病苯妥英鋰水揚酸異戊巴比妥雙香豆素阿司匹林安替匹林保泰松遺傳和非遺傳因素在藥物代謝中的作用藥物代謝及疾病，遺傳與非遺傳的影響0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%110新的醫(yī)學模式:個體化治療（PersonalizedTherapy）根據分子診斷提出治療方案診斷分子診斷-預測反應治療理想反應藥理學+基因組學新的醫(yī)學模式:診斷分子診斷-預測反應治療理想反應11基因個體化治療匯總課件12基因個體化治療匯總課件13基因個體化治療匯總課件14基因是載有特定生物遺傳信息的DNA分子片斷，人類基因包括兩大區(qū)域:1.編碼區(qū)(占5%);2.側翼序列基因是載有特定生物遺傳信息的DNA分子片斷，人類基因包括兩大15

DNA分子是由腺嘌呤（A）、胞嘧啶(C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T，DNA專有）和尿嘧啶（U，RNA專有）堿基排列組成,每個人都存在差異，將其稱為多態(tài)性。人類的基因發(fā)現(xiàn)幾百萬由單一的堿基變換而形成的位點既SNP，它意味著個人間最小的遺傳差異。

A:腺嘌呤T:胸嘧啶G:鳥嘌呤C:胞嘧啶CGTTCTCTATTAACA……GCAAGAGATAATTGT……CGTGCTCTATTAACA……GCACGAGATAATTGT……藥物相關基因研究A:腺嘌呤CGTTCTCTATTAACA……CGTGCTC1610q24.2Chromosome10CYP2C9gene9Exon55kb490AA10q24.2CGTASNPCYP2C9*1NormalenzymaticactivityGAGGACCGTGTTCAAGluAspArgValGln5’3’CYP2C9*2NoenzymaticactivityT430C>T(Arg144Cys)Cys單核苷酸多態(tài)性（SNP）導致人類遺傳易感性的重要因素導致人類藥物代謝和反應差異的重要因素GT突變野生型突變型10q24.2Chromosome10CYP2C9gen17變態(tài)反應藥動學代謝吸收、分布、排泄藥效學靶向結合作用免疫系統(tǒng)毒副作用治療作用藥物耐受藥物代謝酶藥物轉運蛋白藥物靶蛋白、受體人類白血球抗原藥物作用基因與藥物作用的關系原理基因蛋白合成舉例：抗癲癇藥丙戊酸鈉的相關代謝酶——CYP2C19其基因最主要的兩個突變位點

CYP2C19*2:第5外顯子681位G→ACYP2C19*3:第4外顯子636位G→A產生終止密碼，過早終止蛋白合成，產生無活性CYP2C19酶，降低對丙戊酸代謝，使其在體內蓄積，發(fā)生毒副反應18變態(tài)反應藥動學藥效學毒副作用藥物代謝酶藥物轉運蛋白...CCATTGAC......CCATTGAC...…GGTAACTG...…GGTAACTG......CCATTGAC......CCGTTGAC...…GGTAACTG...…GGCAACTG......CCGTTGAC......CCGTTGAC...…GGCAACTG...…GGCAACTG...A/A野生型純合子單核苷酸多態(tài)性形成三種基因型和表型XXXA/a野生型雜合子a/a突變純合子高活性中活性低活性...CCATTGAC......CCA19GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人WildtypeMutationWildtypeConcentrationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450

相同的劑量不同的血漿濃度P450酶活性與PD/PK值的關系GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人Wildt20吸收-慢

-快受體-缺失-豐富代謝

-慢速-中等-快速-超快速排泄

-緩慢-正常藥物體內過程)吸收藥物代謝酶藥物轉運分布藥物轉運代謝藥物代謝酶排泄藥物轉運藥物相關基因研究吸收受體代謝排泄21CYP450

主要存在于肝微粒體中,它的活性決定藥物的代謝速率,與藥物的清除率有著直接關系。CYP450酶系的基因主要有CYP1,CYP2,CYP3三家族,有以下幾種重要的P450酶:CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。藥物代謝酶CYP450主要存在于肝微粒體中,它的活性決定藥物的代22根據CYP2D6基因型調整抗抑郁藥劑量3839米帕明多慮平馬普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕羅西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM18213217480301288138174129928113217941811259811915292118138747593115135941161327084110130641159360148170523838%平均劑量根據CYP2D6基因型調整抗抑郁藥劑量3839米帕明多慮平馬23關于CYP2D6的表型判斷舉例：關于CYP2D6的表型判斷，CYP2D6屬于細胞色素P450酶常見藥物代謝酶基因型及表型判斷舉例：關于CYP2D6的表型判斷，CYP2D6屬于細胞色素P24Β1受體基因突變藥物計量調整Β1受體基因突變藥物計量調整25

美托洛爾，根據CYP2D6基因調整劑量26美托洛爾，根據CYP2D6基因調整劑量26高血脂藥物及硝酸甘油高血脂藥物及硝酸甘油27雌激素與兒童智商相關基因雌激素與兒童智商相關基因28【英國《每日郵報》網站3月23日報道】科學家發(fā)現(xiàn)了一種會增加兒童智商低下風險的基因。這個發(fā)現(xiàn)意味著，在新生兒出生后不久對其進行一項基因檢測，可能會有助于發(fā)現(xiàn)存在上述問題的嬰兒，甚至為應對這一問題確定治療方案做好準備?？茖W家認識到，如果7歲以下兒童在體內出現(xiàn)一種常見基因變異體的同時，甲狀腺激素水平也出現(xiàn)下降，那么他們的智商變得異常低下的可能性將為其他兒童的4倍。每年約有4%的新生兒帶有這種基因，而且體內的甲狀腺激素水平較低。給這些兒童服用含有甲狀腺激素的藥片，或許可以幫助其大腦正常發(fā)育并達到正常水平的智商。每年將會有3萬名兒童因此受益。這項新研究的關注重點是與細胞內甲狀腺激素的產生有關的Ⅱ型脫碘酶。研究人員此前已將這種酶的基因突變與包括糖尿病和高血壓在內的其他健康問題聯(lián)系在一起。在上述新研究中，加的夫大學和布里斯托爾大學的科學家對3123名7歲以下兒童的基因數據進行了分析。這些兒童也接受了智商測試。體內甲狀腺激素水平較低且存在Ⅱ型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于85的可能性是其他兒童的4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問題的兒童不會面臨更多智商低下的風險。加的夫大學的皮特·泰勒博士說：“如果其他研究證實了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時進行針對這種基因變異體的測試，將有助于識別出今后最有可能變得智商低下的那些兒童?！毕嚓P研究結果是在于利物浦召開的英國內分泌協(xié)會大會上發(fā)布的。

兒童DIO2基因突變導致智商低下的研究【英國《每日郵報》網站3月23日報道】科學家發(fā)現(xiàn)了一種會增加29在上述新研究中，加的夫大學和布里斯托爾大學的科學家對3123名7歲以下兒童的基因數據進行了分析。這些兒童也接受了智商測試。體內甲狀腺激素水平較低且存在Ⅱ型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于85的可能性是其他兒童的4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問題的兒童不會面臨更多智商低下的風險。加的夫大學的皮特·泰勒博士說：“如果其他研究證實了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時進行針對這種基因變異體的測試，將有助于識別出今后最有可能變得智商低下的那些兒童?！毕嚓P研究結果是在于利物浦召開的英國內分泌協(xié)會大會上發(fā)布的。

兒童DIO2基因突變導致智商低下的研究在上述新研究中，加的夫大學和布里斯托爾大學的科學家對312330本世紀，腫瘤的藥物治療取得了巨大成就。但腫瘤細胞的多藥耐藥性和腫瘤藥物治療的個體差異常造成腫瘤化療的失敗，且引起嚴重的毒副反應。個體藥物治療的藥效和毒性的差異在很大程度上受到遺傳因素如藥物代謝酶、藥物轉運蛋白和藥物作用靶點等藥物相關基因的遺傳多態(tài)性的影響。所以抗惡性腫瘤藥臨床有效率為30-80%腫瘤個體化治療與基因檢測本世紀，腫瘤的藥物治療取得了巨大成就。但腫瘤細胞的多藥耐藥性31根據病人的遺傳特征,選擇最有效的疾病治療方法，更好地控制疾病的進展甚至預防疾病的發(fā)生，實現(xiàn)最佳的醫(yī)學治療效果。

在合適的時間(RightTime)給合適的病人(RightPatient)施行合適的治療(RightTreatment),達到腫瘤個體化治療腫瘤個體化治療與基因檢測根據病人的遺傳特征,選擇最有效的疾病治療方法，更好地控制32腫瘤個體化治療包括靶向治療和化療兩部分:靶向治療:通過實時定量、基因測序、FISH等技術檢測腫瘤患者基因拷貝及基因突變信息，根據檢測結果進行靶向治療。個體化化療：通過實時定量、基因分型、mRNA定量等技術，檢測患者腫瘤標本或血液標本的mRNA表達、DNA的SNP分型，確定患者對化療藥物的敏感性和毒性反應并確定化療劑量。腫瘤個體化治療與基因檢測腫瘤個體化治療包括靶向治療和化療兩部分:腫瘤個體化治療與基因33腫瘤細胞基因表達與化療藥物腫瘤細胞基因表達與化療藥物34突變基因與化療藥物突變基因與化療藥物35腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測36果因PPT工作室/guoyinppt原位雜交技術

2014-03-19果因PPT工作室/guoyinppt原37原位雜交技術一原位雜交技術的歷史發(fā)展二原位雜交技術的原理及分類三原位雜交技術的一般過程四原位雜交技術的應用原位雜交技術一原位雜交技術的歷史發(fā)展二原位雜交技術38一、原位雜交技術的歷史發(fā)展

原位雜交技術(Insituhybridization，ISH)是分子生物學、組織化學及細胞學相結合而產生的一門新興技術，始于20世紀60年代。1969年美國耶魯大學的Gall等首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，將該基因進行定位，與此同時Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發(fā)展，特別是20世紀70年代末到80年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNA的構建成功，為原位雜交技術的發(fā)展奠定了深厚的技術基礎。

一、原位雜交技術的歷史發(fā)展原位雜交技術(Insit39二、原位雜交技術的原理及分類概念：原位雜交技術(Insituhybridization，ISH)是用標記的核酸探針，經放射自顯影或非放射檢測體系，在組織，細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段。原理：利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，經一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。二、原位雜交技術的原理及分類概念：原位雜交技術(Ins40原位雜交法分類1、基因組原位雜交技術基因組原位雜交(GISH)技術是20世紀80年代末發(fā)展起來的一種原位雜交技術。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當的濃度作封阻，在靶染色體上進行原位雜交。

2、熒光原位雜交技術熒光原位雜交(FISH)技術是在已有的放射性

原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放

射性DNA分子原位雜交技術。它利用熒光標記

的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切

片上的特異性雜交，通過熒光檢測系

統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測信號DNA序列在染色體或

DNA顯微切片上的目的DNA序列，進而確定其雜

交位點。原位雜交法分類1、基因組原位雜交技術413、多彩色熒光原位雜交技術多彩色熒光原位雜交(mFISH)是在熒

光原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的

一種新技術，它用幾種不同顏色的熒

光素單獨或混合標記的探針進行原位

雜交，能同時檢測多個靶位，各靶位

在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，

呈現(xiàn)多種色彩。4、原位PCR原位PCR技術是常規(guī)的原位雜交技術與PCR技術的有機結合，即通過PCR技術對靶核酸序列在染色體上或組織細胞內進行原位擴增使其拷貝數增加，然后通過原位雜交技術進行檢測，從而對靶核酸序列進行定性、定位和定量分析。原位雜交法分類3、多彩色熒光原位雜交技術原位雜交法分類42三、原位雜交技術的一般過程以經過標記的已知核酸分子為探針以細胞內與探針序列互補的特異核酸分子為靶分子在一定條件下使探針與靶核酸分子在原位發(fā)生雜交再對其探測三、原位雜交技術的一般過程以經過標記的已知核酸分子為探針43探針標記靶核酸分子雜交檢測探針標記靶核酸分子雜交檢測44一）、探針

是含有互補順序的外源性被標記的DNA或RNA片段，是在原位雜交中用于檢測細胞內特定DNA或RNA順序定位的特殊試劑，探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結合上1、cDNA2、RNA3、寡核苷酸一）、探針是含有互補順序的外源性被標記的DNA或RNA片451、cDNA(complementaryDNA)互補于mRNA的DNA分子（長度為數百-數千堿基對）⑴克隆于質粒中，可以無限繁殖，取之不盡⑵較穩(wěn)定，不易被降解⑶標記方法可靠易行優(yōu)點1、cDNA互補于mRNA的DNA分子⑴克隆于質粒中46優(yōu)點：⑴雜交效率比DNA探針高

⑵在檢測mRNA時所形成的RNA-mRNA雜交體比DNA-mRNA雜交體穩(wěn)定

⑶可以同時得到同義RNA鏈和反義RNA鏈缺點：2、RNA

RNA是單鏈分子（探針長度50-300堿基對）容易受RNA酶的污染而被降解優(yōu)點：2、RNARNA是單鏈分子容易受47

這類探針是根據靶分子而設計序列在DNA合成儀上用化學方法合成

優(yōu)點：形成雜交體快速（序列短鏈，雜交時易于穿透）

缺點：特異性較低（短鏈和簡單）短鏈探針(長度10-50個核苷酸)3、寡核苷酸這類探針是根據靶分子而設計序列短鏈探針3、寡核48

二）、探針標記1、標記物

（1）放射性標記物

（2）非放射性標記物2、標記方法

（1）DNA探針標記

（2）RNA探針標記

（3）寡核苷酸探針標記

二）、探針標記1、標記物（1）放射性標記物491、標記物①高度靈敏性；②標記物與核酸探針結合，應絕對不能影響核酸探針與模板的結合能力及結合的特異性；③當用酶促方法進行標記時，應對酶促活性（Km值）無多大影響，以保證標記反應的效率和標記產物的比活性；④高度特異性；⑤較高的化學穩(wěn)定性，保存時間長，標記及檢測方法簡單；⑥對環(huán)境無污染，對人體無損傷；⑦價格低廉等。1、標記物①高度靈敏性；50標記物分類放射性標記物：同位素35S、33P、32P和3H等非放射性標記物：熒光素生物素地高辛

溴脫氧尿嘧啶等標記分子：某種單核苷酸在單核苷酸分子中導入某個原子、功能基團或側鏈分子作為標記物，對堿基配對不造成影響標記物分類放射性標記物：同位素35S、33P、32P和51標記分子：放射性標記分子：

35S-UTP35S-dATP

35S-dCTP

32P-UTP32P-dATP等等非放射性標記分子：

四甲基羅達明-UTP

生物素-UTP(Bio-UTP)

地高辛-dUTP(Dig-dUTP)

溴脫氧尿嘧啶本身為標記分子標記分子：522、標記方法（1）DNA探針標記

切口移位法隨機引物法（2）RNA探針標記

在體外轉錄技術中與探針制備同時完成（3）寡核苷酸探針標記

末端轉移法將放射性或非放射性的標記分子在各種酶促反應中參入探針分子2、標記方法（1）DNA探針標記將放射性或非放射性的標記分子53切口平移法切口平移法54隨機引物法隨機引物法55

三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：指所要探測的核酸分子或核苷酸序列（DNA或RNA）

DNA——可以是中期染色體上的或是間期細胞核內的，也可以是線粒體DNA或病毒DNARNA——可以是編碼細胞合成的任何蛋白質分子的mRNA，也可以是核糖體rRNA線粒體或病毒RNA三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：56四）、雜交

1.雜交體

2.雜交條件

3.嚴格度的概念四）、雜交571、雜交體hybrids

DNA-DNADNA-RNARNA-RNA穩(wěn)定性依次是：DNA-DNA＜DNA-RNA＜RNA-RNA1、雜交體hybrids58DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復性DNA-DNA變性復性592、雜交條件（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（5）時間（1）、雜交液

①鈉鹽（雜交效率↑非特異反應↓）②甲酰胺（使雜交所需溫度降低裂解紅細胞）

③硫酸葡聚糖（提高探針濃度）

④牛血清白蛋白和載體DNA等（阻斷探針與組織非特異結合，↓背景）2、雜交條件（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH60雜交條件

（2）、探針濃度

探針濃度影響雜交反應的速度

放射性標記探針0.5μg/ml非放射性為2μg/ml最適宜的探針濃度要經實驗摸索得到確定（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（5）時間雜交條件

（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH61雜交條件（3）、溫度雜交時溫度一般低于相應雜交體的Tm值25℃Tm值：是核酸的融解溫度，是一半雙鏈分子解鏈時的溫度）

當雜交液含50%甲酰胺、鹽濃度0.75mol/L左右時雜交溫度：對DNA探針是42℃對RNA探針是50-55℃對寡核苷酸探針是37℃1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（5）時間雜交條件1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（562雜交條件（4）、PH

pH在5-9范圍內，雜交體形成不受影響

常用緩沖液pH為6.5-7.5（5）、時間一般探針濃度下，雜交反應在4-6小時內完成孵育6小時后-雜交信號不再增強反應超過24小時后-已形成的雜交體可能發(fā)生解鏈，雜交信號反而減弱（1）