靶向檢測(cè)技術(shù)

靶向檢測(cè)技術(shù)第1頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月LungCancerinSolidTumorinChina第2頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月=？液態(tài)活檢通過(guò)外周血中的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤基因組信息來(lái)評(píng)估腫瘤病理活檢通過(guò)原發(fā)灶腫瘤組織來(lái)評(píng)估腫瘤CTCctDNA

mircoRNALNCRNAOthers

傳統(tǒng)的組織細(xì)胞學(xué)檢測(cè)第3頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月液態(tài)活檢在肺癌中的應(yīng)用治療策略事件肺癌待查輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)治療方案選擇療效評(píng)估耐藥機(jī)理新藥研發(fā)第4頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月治療策略事件疑似肺癌輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)治療方案選擇耐藥機(jī)理新藥研發(fā)CTC的臨床應(yīng)用價(jià)值療效評(píng)估CTC(數(shù)量）(負(fù)向富集+靶向PCR）ctDNA(基因變異）第5頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、K.Pantel,etal.NatRevClinOncol,2009;2、K.PantelandMR.Speicher,Oncogene2015什么是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CirculatingTumorCell，CTC）？腫瘤釋放如外周血中CTCs數(shù)量的多少，可間接反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CTC：在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞和不具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞，均由原發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CirculatingTumorCell）CTC1CTC≠有轉(zhuǎn)移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC（disseminatedTumorCell），只有由具有干細(xì)胞特征的DTC所形成的微轉(zhuǎn)移灶，逃避免疫識(shí)別才可能發(fā)展成為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移2第6頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第9周的乳腺管組織切片：乳腺管周圍非典型性增生第30周的腫瘤組織切片：新生的腫瘤上皮細(xì)胞形成牙槽并侵襲周圍基質(zhì)CK+cellsHER-2+cells什么時(shí)候可以檢測(cè)到CTC？早期腫瘤外周血中即可檢出CTC第7頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月WHe,etal.ProcNatlAcadSci,2007早期腫瘤外周血中即可檢出CTC表達(dá)中等量FR的M109鼠肺癌細(xì)胞通過(guò)皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側(cè)面移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測(cè)到大約1.4個(gè)CTC細(xì)胞移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測(cè)7個(gè)和18個(gè)CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)到存在轉(zhuǎn)移性癌癥的跡象第8頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CTC富集技術(shù)密度與大小免疫磁珠（負(fù)向富集or陽(yáng)性富集)微流體CTC

檢測(cè)方法CTC檢測(cè)技術(shù)靶向PCR免疫熒光普通PCR=+第9頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月“方法”“收獲”“垃圾”蟹餌沒水了，我們躲不了了放水負(fù)向富集優(yōu)勢(shì)：回收率100%劣勢(shì)：純度略低正向富集優(yōu)勢(shì)：純度高劣勢(shì)：回收率低（漏掉CTC）幸好沒貪嘴，我們逃了第10頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月“方法”“收獲”“垃圾”沒水了，我們躲不了了放水負(fù)向富集優(yōu)勢(shì)：回收率100%劣勢(shì)：純度略低大小富集（ISET）優(yōu)勢(shì)：簡(jiǎn)單劣勢(shì)：漏掉小的CTC細(xì)胞幸好沒吃胖，我們逃了網(wǎng)篩第11頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CTC檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)原理負(fù)向富集靶向PCRFR陽(yáng)性靶標(biāo)肺癌細(xì)胞FR(葉酸受體）高度表達(dá)CTC：FR=1:50萬(wàn)EMT轉(zhuǎn)化不影響FR豐度其他血細(xì)胞不表達(dá)FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自動(dòng)化靈敏度超高，負(fù)向富集可滿足檢測(cè)要求信號(hào)二次放大，1個(gè)CTC信號(hào)放大10^12倍無(wú)需人工經(jīng)驗(yàn)判讀，結(jié)果客觀準(zhǔn)確可實(shí)現(xiàn)CTC的定量第12頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CTC檢測(cè)

靶向PCR，信號(hào)放大，保證高度敏感性

1個(gè)CTC信號(hào)放大1012倍第13頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CTC檢測(cè)優(yōu)勢(shì)一：陰性富集不丟失循環(huán)腫瘤細(xì)胞優(yōu)勢(shì)二：靶向探針特異性高優(yōu)勢(shì)三：PCR擴(kuò)增信號(hào)，確保高敏感性優(yōu)勢(shì)四：PCR儀判斷CTC技術(shù)，避免人為誤差第14頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3mL血1mL/3mL血3mL血1個(gè)CTC/3mL血50萬(wàn)FR/1個(gè)CTC1個(gè)CTC/1slide100萬(wàn)信號(hào)/1個(gè)FR1個(gè)信號(hào)/1個(gè)CTCFR靶向PCR——1個(gè)CTC細(xì)胞信號(hào)方法10^12倍（萬(wàn)億倍）細(xì)胞免疫熒光——1個(gè)CTC細(xì)胞信號(hào)幾乎沒有放大第15頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CellSearch:正向富集+免疫熒光技術(shù)進(jìn)行捕獲和鑒定16EpCAM–上皮細(xì)胞粘附分子APC–異藻藍(lán)蛋白熒光染料CK–細(xì)胞角蛋白PE–藻紅蛋白熒光染料DAPI–4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料）上皮細(xì)胞白細(xì)胞抗EpCAM磁流體EpCAM抗原CD45抗原CK抗原抗CD45-APC染料抗CK-PE染料熒光染料第16頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EpCAM陰性細(xì)胞中，存在大量CTCCellResearch系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做為探針

研究證實(shí)，EpCAM陰性的細(xì)胞中也存在CTCJiataoLou,etal.PlosOne2013第17頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2004CellSearch:乳腺癌中檢測(cè)出，但肺癌敏感性低2011CellResearch:采用的抗體(EpCAM)對(duì)EMT細(xì)胞特異性差，而肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移入血需要EMT的過(guò)程第18頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第19頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3mL血→6個(gè)小時(shí)→得到報(bào)告檢測(cè)流程第20頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月肺癌領(lǐng)域，CTC檢測(cè)技術(shù)對(duì)比CytoploRare?（格諾）CellSearch?CyttelTM（北京萊爾）CanpatrolTM（益善）CTC-Biopsy?（武漢友之友)核心技術(shù)免疫磁珠負(fù)向富集靶向配體PCR技術(shù)

流式正向富集技術(shù)熒光標(biāo)記免疫磁珠負(fù)向富集、Fish技術(shù)ISET（濾膜）原位雜交RNA分析ISET（濾膜)熒光標(biāo)記特異性88%80%83%75%70%靈敏度80%30%腺癌：46%30%30%自動(dòng)化半自動(dòng)全自動(dòng)半自動(dòng)半自動(dòng)全自動(dòng)血樣體積3mL7.5mL4mL5mL10mL適應(yīng)癥早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌腫晚期癌腫早期（I期）敏感性67%0%20%(2/10)未報(bào)道未報(bào)道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%報(bào)告時(shí)間6h/12樣本6h/8樣本48h/1樣本48h/1樣本3天可視化否是是是是第21頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月不同CTC計(jì)數(shù)對(duì)于肺癌診斷的特異性與敏感性CTC計(jì)數(shù)診斷肺癌敏感性診斷肺癌特異性2.099.5%2.3%4.096.1%21.3%6.089.5%44.8%8.778.0%83.6%10.068.1%90.3%12.054.1%95.2%14.040.1%97.6%16.027.6%98.1%18.020.5%98.6%20.016.2%99.5%第22頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CTC對(duì)肺癌的診斷顯著優(yōu)于一般腫瘤標(biāo)志物輔助診斷指標(biāo)AUC值P值CTC0.91P<0.0001CEA0.56NSE0.61CYFRA21-10.71SCCA0.49CTC與一般腫瘤標(biāo)志物對(duì)肺癌診斷的準(zhǔn)確性（AUC值）第23頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單項(xiàng)CTC檢測(cè)的輔助診斷價(jià)值優(yōu)于多個(gè)一般腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合AUC=0.91,P<0.0001AUC=0.76第24頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月不同病理類型中，CTC輔助診斷價(jià)值均優(yōu)于一般腫瘤標(biāo)志物第25頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CTC肺癌輔助診斷小結(jié)CTC反應(yīng)肺癌發(fā)生發(fā)展功能狀態(tài)，肺癌輔助診斷價(jià)值顯著優(yōu)于一般腫瘤標(biāo)志物靶向PCRCTC技術(shù)：所有肺癌敏感性提高3倍，I期肺癌提高10倍第26頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CTC：用于化療療效評(píng)估，先于腫瘤大小發(fā)生變化，評(píng)估腫瘤功能狀態(tài)NSCLC,1st-linecarboplatin,paclitaxel(d);NSCLC,2nd-linepemetrexed(e)BaselineCTscanswerebeforetherapyinitiationandCTCmeasurementsbeganatorshortlyafterthefirsttreatment.第27頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CTC數(shù)量變化與RECIST標(biāo)準(zhǔn)基本一致第28頁(yè)，課件共30頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月FR靶向PCRCTC檢測(cè)

與肺腺癌患者一線培美曲塞化療療效相關(guān)培美曲塞是一種抗葉酸制劑，通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過(guò)程，抑制細(xì)胞復(fù)制，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)FR靶向PCRCTC檢測(cè)技術(shù)特異性檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞