化妝品生產(chǎn)用水標準化妝品檢驗標準

化妝品生產(chǎn)用水標準［化妝品檢驗標準］七分妝公司成品檢驗QA程序一、檢驗程序檢查重量使用電子稱稱凈重（必須先除皮）2檢查外觀產(chǎn)品外觀實施瓶瓶全檢，查看包裝外表是否有臟點、污點、缺陷3化妝品標簽標簽是否貼錯/反/漏，標簽是否有色差4抽樣抽樣數(shù)量為5?，抽樣檢查為微生物查驗5留樣檢驗合格后每批產(chǎn)品留樣數(shù)量應(yīng)足夠兩次檢驗，并且在有效期內(nèi)不得轉(zhuǎn)移。二、微檢基本點1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗總則。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存、供檢樣品制備。儀器和設(shè)備2.1天平。2.2高壓滅菌器。2.3振蕩器。2.4三角瓶。2.5玻璃珠。2.6玻璃棒。2.7刻度吸管。2.8研缽。2.9均質(zhì)器。2.10恒溫水浴箱。2.11采樣用具：不銹鋼勺，剪刀，開罐器等。培養(yǎng)基和試劑3.1生理鹽水成分：氯化鈉蒸餾水加至.5g1000mL溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶內(nèi)，每瓶90mL,103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌。3.2SCDLP液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白胨大豆蛋白胨氯化鈉磷酸氫二鉀葡萄糖卵磷脂吐溫80蒸餾水17g3g5g2.5g2.5g1g7g1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào)pH為7.2?7.3,分裝，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25℃左右使用。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。3.3滅菌液體石蠟。3.4滅菌吐溫80。樣品的采集及注意事項所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝。檢驗時，應(yīng)分別從兩個包裝單位以上的樣品中共取10g或10mL。包裝量小于20g的樣品，采樣量應(yīng)適量增加，其總量應(yīng)大于16g。供檢驗樣品，應(yīng)嚴格保持原有的包裝狀態(tài)，進口產(chǎn)品應(yīng)為市售包裝。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗前不得打開，防止樣品被污染。接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求盡快檢驗。如不能及時檢驗，樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。若只有一份樣品而同時需做多種分析，如微生物、毒理、化學(xué)等，應(yīng)先做微生物檢驗，再將剩余樣品做其它分析。在檢驗過程中，從打開包裝到全部檢驗操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴散，所用采樣用具、器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進行，或在相應(yīng)條件下，按無菌操作規(guī)定進行。供檢樣品的制備5.1液體樣品5.1.1水溶性的液體樣品，量取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1:10檢液。5.1.2油性液體樣品，取樣品10mL,先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80,在40℃~44℃水浴中振蕩混合10山皿，加入滅菌的生理鹽水75mL（在40℃~44℃水浴中預(yù)溫），在40℃~44℃水浴中乳化，制成1:10的懸液。5.2膏、霜、乳劑半固體狀樣品親水性的樣品，稱取10g,加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。取其上清液作為1:10的檢液。疏水性樣品，稱取10g,放到滅菌的研缽中，加10mL滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70mL滅菌生理鹽水，在40℃~44℃水浴中充分混合，制成1:10檢液。5.3固體樣品，稱取10g,加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1:10的檢液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱10g樣品加入90mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min?2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品，加10mL滅菌液體石蠟，10mL滅菌吐溫80,70mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min?5min。三、菌落總數(shù)AerobicBacterialCount1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗方法。本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測定。2定義本規(guī)范采用下列定義菌落總數(shù)(aerobicbacterialcount)是指化妝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH值、需氧性質(zhì)等)，1g(1mL)檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測定菌落總數(shù)便于判明樣品被細菌污染的程度，是對樣品進行衛(wèi)生學(xué)總評價的綜合依據(jù)。3儀器和設(shè)備3.1三角瓶。3.2量筒。pH計或精密pH試紙。3.4高壓滅茵器。3.5試管。平皿：直徑9cm?？潭任埽?0mL、2mL、1mL。3.8酒精燈。3.9恒溫培養(yǎng)箱。3.10放大鏡。4培養(yǎng)基和試劑4.1生理鹽水：見總則中3.1。4.2卵磷脂、吐溫80—營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.2.1成分：蛋白胨牛肉膏氯化鈉瓊脂卵磷脂吐溫80蒸餾水20g3g5g15g1g7g1000mL4.2.2制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分(除瓊脂外)加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80,混勻，調(diào)pH值為7.1?7.4,加入瓊脂，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌，儲存于冷暗處備用。4.30.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenylterazoliumchloride,TTC)成分:TTC0.5g蒸餾水100mL溶解后過濾，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4℃冰箱備用。5操作步驟用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL,分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面)，更換一支吸管，并充分混勻，制成1:100檢液。吸取2mL,分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，??等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。將融化并冷至45℃~50℃的卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL,隨即轉(zhuǎn)動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)h。另取一個不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48卜，為空白對照。為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1山10.5%的TTC溶液，如有細菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色,而化妝品的顆粒顏色無變化。菌落計數(shù)方法先用肉眼觀察，點數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大5?10倍的放大鏡檢查,以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后,求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時,該平皿不宜計數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半,而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻,則可將此半個平皿菌落計數(shù)后乘以2,以代表全皿菌落數(shù)。菌落計數(shù)及報告方法首先選取平均菌落數(shù)在30?300個之間的平皿，作為菌落總數(shù)測定的范圍。當只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見表1中例1）。7.2若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30?300個之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于2，應(yīng)報告其平均數(shù)，若大于2則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見表1中例2及例3）。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例4）。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1例5）。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30?300個之間，其中一個稀釋度大于300個，而相鄰的另一稀釋度小于30個時，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例6）。若所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每g或每mL小于10CFU。菌落計數(shù)的報告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時，按實有數(shù)值報告之，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計算。為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù)，可用10的指數(shù)來表示(見表1報告方式欄)。在報告菌落數(shù)為“不可計”時，應(yīng)注明樣品的稀釋度。表1菌落計數(shù)結(jié)果及報告方式四、糞大腸菌群FecalColiforms1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗方法。本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗。2定義本規(guī)范采用下列定義糞大腸菌群(Fecalcoliforms)系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5℃培養(yǎng)24h?48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌人和溫血動物糞便，是重要的衛(wèi)生指示菌。3儀器3.1恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44℃±0.5℃。3.2溫度計。3.3顯微鏡。3.4載玻片。3.5接種環(huán)。3.6電爐。3.7三角瓶。3.8試管。3.9小倒管。3.10pH計或pH試紙。3.11高壓滅茵器。3.12刻度吸管：10mL、2mL、1mL。3.13平皿。4培養(yǎng)基和試劑4.1雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基成分：蛋白胨豬膽鹽乳糖0.4%溴甲酚紫水溶液蒸餾水40g10g10g5mL1000mL制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解于蒸餾水中，調(diào)pH到7.4,加入0.4%溴甲酚紫水溶液5mL，混勻，分裝試管(每支試管中加一個小倒管)。68.95kPa(10lb)20min滅菌。4.2伊紅美蘭(EMB)瓊脂成分：蛋白胨乳糖磷酸氫二鉀10g10g2g瓊脂2%伊紅水溶液0.5%美藍水溶液蒸餾水20g20mL13mL1000mL制法：先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀、蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補足至1000mL。校正pH值為7.2?7.4,分裝于三角瓶內(nèi)，103.43kPa（15lb）15min高壓滅菌備用。臨用時加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60℃左右無菌操作加入滅菌的伊紅美藍溶液，搖勻。傾注平皿備用。4.3蛋白胨水（作靛基質(zhì)試驗用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）氯化鈉蒸餾水高壓滅菌。4.4靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。試驗方法：接種細菌于蛋白胨水中，于44±0.5℃培養(yǎng)24h。沿管壁加柯凡克試劑0.3?0.5mL,輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買來后，應(yīng)先用已知菌種后方可使用。4.5革蘭氏染色液：4.5.1染液制備4.5.1.1結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫95%乙醇1%草酸銨水溶液4.5.1.2革蘭氏碘液：碘碘化鉀蒸餾水加至300mL。4.5.1.3脫色液：95%乙醇。4.5.1.4復(fù)染液：a.沙黃復(fù)染液：沙黃95%乙醇蒸餾水將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。b.稀石碳酸復(fù)紅液:稱取堿性復(fù)紅10g,研細，加95%乙醇100mL,放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL,加5%石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液10mL加水90mL，即為稀石碳酸復(fù)紅液。20g5g1000mL制法：將上述成分加熱融化，調(diào)pH值為7.0?7.2,分裝小試管，103.43kPa(15lb)15min1g20mL80mL將結(jié)晶紫溶于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。1g2g300mL將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至0.25g10mL90mL4.5.2染色法將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染Imin,水洗。4.5.2.2滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脫色，約30s，或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s，水洗。滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。4.5.3染色結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注:如用1:10稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染，復(fù)染時間僅需10s。5操作步驟取10mL1:10稀釋的檢液，加到10mL雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置44℃±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h?48h,如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則為糞大腸菌群陰性。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18h?24h。同時取該培養(yǎng)液1?2滴接種到蛋白胨水中，置44℃土0.5℃培養(yǎng)24h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上有無典型菌落生長。糞大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。5.3挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL,觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。6檢驗結(jié)果報告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。五、綠膿桿菌PseudomonasAeruginosa1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中綠膿桿菌的檢驗方法。本規(guī)范適用于化妝品中綠膿桿菌的檢驗。2定義本規(guī)范采用下列定義。綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃條件下能生長。該菌對人有致病力，可使傷處化膿，引起敗血癥等。3儀器3.1恒溫培養(yǎng)箱：37℃、42℃。3.2三角瓶。3.3試管。3.4平皿。3.5刻度吸管：10mL、2mL、1mL。3.6顯微鏡。3.7載玻片。3.8接種針、接種環(huán)。3.9電爐。3.10高壓滅茵器。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見總則中3.2。4.2十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基成分：牛肉膏蛋白胨氯化鈉十六烷基三甲基溴化銨瓊脂蒸餾水lb)20min滅菌后，制成平板備用。4.3乙酰胺培養(yǎng)基成分：乙酰胺氯化鈉無水磷酸氫二鉀10g5g1.39g3g10g5g0.3g20g1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)pH為7.4?7.6,加入瓊脂，68.95kPa(10無水磷酸二氫鉀硫酸鎂(MgSO4?7H2O)瓊脂蒸餾水0.73g0.5g20g1000mL酚紅0.012g（1.2%溶液1mL）制法：除瓊脂和酚紅外，將其它成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH為7.2,加入瓊脂、酚紅，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌后，制成平板備用。4.4綠膿菌素測定用培養(yǎng)基成分：蛋白胨氯化鎂硫酸鉀瓊脂甘油(化學(xué)純)蒸餾水20g1.4g10g18g10g1000mL制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使其溶解，調(diào)pH至7.4,加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，68.95kPa(10lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?.5明膠培養(yǎng)基成分：牛肉膏蛋白胨明膠蒸餾水3g5g120g1000mL制法：取各成分加到蒸餾水中浸泡20min，隨時攪拌加溫使之溶解，調(diào)pH至7.4，分裝于試管內(nèi)，經(jīng)68.95kPa(10lb)20min滅菌后，直立制成高層備用。4.6硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分：蛋白胨酵母浸膏硝酸鉀亞硝酸鈉蒸餾水10g3g2g0.5g1000mL制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調(diào)pH為7.2，煮沸過濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，68.95kPa(10lb)20min滅菌后備用。4.7普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分：蛋白胨牛肉膏氯化鈉瓊脂蒸餾水10g3g5g15g1000mL制法:除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH為7.2?7.4,加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆?。操作步驟增菌培養(yǎng)：取1:10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)18h?24h。如有綠膿桿菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍綠色。5.2分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷基三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18h?24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴散有水溶性色素，此培養(yǎng)基選擇性強，大腸艾希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。在缺乏十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基時也可用乙酰胺培養(yǎng)基進行分離，將菌液劃線接種于平板上，放37℃培養(yǎng)24h,綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其它菌不生長。染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進行氧化酶試驗。氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對苯二胺試液，在15s?30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗陰性。5.5綠膿菌素試驗：取可疑菌落2?3個，分別接種在綠膿菌素測定培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)24h,加入氯仿3mL?5mL,充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。明膠液化試驗，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃培養(yǎng)24h,取出放冰箱10min?30min,如仍呈溶解狀時即為明膠液化試驗陽性；如凝固不溶者為陰性。42℃生長試驗：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在41?42℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h?48h,綠膿桿菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。檢驗結(jié)果報告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，在分離平板上有典型或可疑菌落生長，經(jīng)證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌；如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。六、金黃色葡萄球菌StaphylocousAureus1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中金黃金色葡萄球菌的檢驗方法。本規(guī)范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗。2定義本規(guī)范采用下列定義金黃色葡萄球菌(Staphylocousaureus)為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。該菌是葡萄球菌中對人類致病力最強的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴重時可導(dǎo)致敗血癥。3儀器和設(shè)備3.1顯微鏡。3.2恒溫培養(yǎng)箱。3.3離心機。3.4刻度吸管：1mL、5mL、10mL。3.5試管。3.6載玻片。3.7酒精燈。培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見總則中3.2。4.2BairdParker氏培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨牛肉膏酵母浸膏丙酮酸鈉甘氨酸氯化鋰(LiCl?6H2O)瓊脂蒸餾水增菌劑的配制：30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，校正pH。分裝每瓶95mL，103.43kPa高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂培養(yǎng)基，每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌10g5g1g10g12g5g20g950mLpH7.0±0.2劑5mL，搖勻后制成平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h。4.3血瓊脂培養(yǎng)基成分：營養(yǎng)瓊脂100mL脫纖維羊血(或兔血)10mL制法：將營養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至50℃左右無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平板，置冰箱內(nèi)備用。4.4甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍溶液12mL蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)口^.4,加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kPa(10lb)20min滅菌備用。4.5兔(人)血漿制備取3.8%酸鈉溶液，103.43kPa(15lb)30min高壓滅菌，1份加兔(人)全血4份，混勻靜置；2000rpm~3000rpm離心3min~5min。血球下沉，取上面血漿。4.6無菌液體石蠟。操作步驟增菌：取1:10稀釋的樣品10mL接種到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取1?2接種環(huán)，劃線接種在BairdParker平板，如無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)24h?48h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在BairdParker平板上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑為2mm?3mm,顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)24h。染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5um?1um。5.4甘露醇發(fā)酵試驗：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入2mm?3mm的滅菌液體石蠟，置37℃培養(yǎng)24h,金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。5.5血漿凝固酶試驗：吸取1:4新鮮血漿0.5mL,放入滅菌小試管中，加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL。混勻，放37℃恒溫箱或恒溫水浴中，每半小時觀察一次，6h之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5mL,分別加入滅菌1:4血漿0.5mL,混勻，作為對照。檢驗結(jié)果報