熒光法課件文檔

第三章熒光法第一節(jié)概述第二節(jié)根本原理第三節(jié)熒光定量分析第四節(jié)儀器與技術(shù)第五節(jié)應(yīng)用與例如熒光分析法教學(xué)要求掌握分子熒光、磷光的產(chǎn)生機(jī)理；掌握激發(fā)光譜和發(fā)射光譜特征。掌握熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系以及溶液對(duì)熒光強(qiáng)度影響的因素。了解熒光分析法的特點(diǎn)及定量測(cè)定方法。了解熒光分析儀器的結(jié)構(gòu)。概述自然界存在這樣一類物質(zhì)，當(dāng)這些物質(zhì)的分子吸收能量后，能發(fā)射出熒光，人們根據(jù)所發(fā)生熒光的特性和強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的方法，稱為熒光分析法〔fluorescenceanalysis〕。熒光分析的特點(diǎn)：靈敏度高：視不同物質(zhì)，檢測(cè)下限在0.1~0.001g/mL之間?？梢姳萓V-Vis的靈敏度高得多！選擇性好：可同時(shí)用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。結(jié)構(gòu)信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強(qiáng)、熒光量子效率、熒光壽命等。應(yīng)用不廣泛：主要是因?yàn)槟馨l(fā)熒光的物質(zhì)不具普遍性、增強(qiáng)熒光的方法有限、外界環(huán)境對(duì)熒光量子效率影響大、干擾測(cè)量的因素較多基態(tài)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相反，稱為激發(fā)單重態(tài)〔S〕抗磁性激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相同，稱為激發(fā)三重態(tài)〔T〕順磁性區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。電子躍遷類型允許躍遷禁阻躍遷分子的去激發(fā)無輻射躍遷輻射躍遷熒光（F）磷光（P）振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移體系間跨越分子的去激發(fā)分子熒光和磷光分析一、根本原理熒光和磷光的產(chǎn)生處于分子基態(tài)單重態(tài)中的電子對(duì)，其自旋方向相反，當(dāng)其中一個(gè)電子被激發(fā)時(shí)，通常躍遷至第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)軌道上，也可能躍遷至能級(jí)更高的單重態(tài)上。如果躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)軌道上，那么屬于禁阻躍遷。單重態(tài)與三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)具有較低能級(jí)。第一節(jié)分子熒光和磷光分析在單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋，單重態(tài)分子具有抗磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命大約為10-8s，而三重態(tài)分子具有順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4~1s以上〔通常用S和T分別表示單重態(tài)和三重態(tài)〕。

分子熒光和磷光分析處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式再回到基態(tài)。輻射躍遷主要涉及到熒光、延遲熒光或磷光的發(fā)射；無輻射躍遷那么是指以熱的形式輻射其多余的能量，包括振動(dòng)弛豫〔VR〕、內(nèi)部轉(zhuǎn)移〔IR〕、體系間跨躍〔IX〕及外部轉(zhuǎn)移〔EC〕等，各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及激發(fā)時(shí)的物理和化學(xué)環(huán)境等因素有關(guān)。分子熒光和磷光分析下面結(jié)合熒光和磷光的產(chǎn)生過程，進(jìn)一步說明各種能量傳遞方式在其中所起的作用。設(shè)處于基態(tài)單重態(tài)中的電子吸收波長為λ1和λ2的輻射光之后，分別激發(fā)至第二單重態(tài)S2及第一單重態(tài)S1。振動(dòng)弛豫它是指在同一電子能級(jí)中，電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多余的能量以熱的形式發(fā)出。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間為10-12s數(shù)量級(jí)。分子熒光和磷光分析內(nèi)轉(zhuǎn)移當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾疗湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。分子熒光和磷光分析熒光發(fā)射〔F〕處于第一激發(fā)單重態(tài)中的電子躍回至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)，將得到最大波長為λ3的熒光。注意：基態(tài)中也有振動(dòng)馳豫躍遷。很明顯，λ3的波長較激發(fā)波長λ1或λ2都長，而且不管電子開始被激發(fā)至什么高能級(jí)，最終將只發(fā)射出波長λ3為的熒光。熒光的產(chǎn)生在10-7-10-9s內(nèi)完成。分子熒光和磷光分析體系間跨躍

指不同多重態(tài)間的無輻射躍遷，例如S1→T1就是一種體系間跨躍。通常，發(fā)生體系間跨躍時(shí)，電子由S1的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至T1的較高振動(dòng)能級(jí)處。有時(shí)，通過熱激發(fā)，有可能發(fā)生T1→S1，然后由S1發(fā)生熒光。這是產(chǎn)生延遲熒光的機(jī)理。分子熒光和磷光分析磷光發(fā)射電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因?yàn)檫@是禁阻躍遷。但是，由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，有可能以體系間跨躍方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)過振動(dòng)馳豫，轉(zhuǎn)至其最低振動(dòng)能級(jí)，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時(shí)，便發(fā)射磷光，這個(gè)躍遷過程〔T1→S0〕也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為10-4-10s。因此，這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。分子熒光和磷光分析外轉(zhuǎn)移指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為“熄滅〞或“猝滅〞。熒光與磷光的根本區(qū)別：熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的；而磷光是由激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的。T1

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(b)

(b)

磷光熒光吸收振動(dòng)弛豫體系間跨越熒光與磷光產(chǎn)生示意圖熒光的檢測(cè)單色器光源檢測(cè)器狹縫單色器吸收池狹縫I0It熒光的檢測(cè)激發(fā)光譜與熒光光譜任何熒〔磷〕光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒〔磷〕光定性分析的根底。1〕激發(fā)光譜改變激發(fā)波長，測(cè)量在最強(qiáng)熒〔磷〕光發(fā)射波長處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長對(duì)熒光強(qiáng)度作圖可得到激發(fā)光譜。激發(fā)光譜與熒光光譜

激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展饽艿倪^程就是分子的激發(fā)過程。激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時(shí)，用于選擇最適宜的激發(fā)波長。激發(fā)光譜與熒光光譜2〕發(fā)射光譜發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長和強(qiáng)度的激發(fā)波長輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長的強(qiáng)度的熒光，以熒光強(qiáng)度對(duì)其波長作圖可得熒光發(fā)射光譜。由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系i〕波長比較與激發(fā)〔或吸收〕波長相比，熒光發(fā)射波長更長。ii〕形狀比較熒光光譜形狀與激發(fā)波長無關(guān)。換句話說，不管激發(fā)波長如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系iii〕鏡像對(duì)稱通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：i〕分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)〔內(nèi)因〕；ii〕吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率F足夠大：分子結(jié)構(gòu)與熒光1〕躍遷類型：通常，具有—*及n—*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會(huì)產(chǎn)生熒光。而且具—*躍遷的熒光效率比n—*躍遷的要大得多。2〕共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強(qiáng)。共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系分子結(jié)構(gòu)與熒光3〕剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：分子剛性〔Rigidity〕越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。如熒光素〔大〕與酚酞〔=0〕；芴(=1〕與聯(lián)苯〔=0.18〕剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8—羥基喹啉8—羥基喹啉鎂剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系7-二甲胺萘–1-磺酸鹽F

=0.758-二甲胺萘–1-磺酸鹽F

=0.03空間位阻與熒光的關(guān)系剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系順反異構(gòu)與熒光的關(guān)系反式結(jié)構(gòu)順式結(jié)構(gòu)1，2—二苯乙烯分子結(jié)構(gòu)與熒光4〕取代基：給電子取代基增強(qiáng)熒光〔p-共軛〕，如-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；重原子降低熒光但增強(qiáng)磷光，如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。影響熒光的外界因素〔一〕溶劑效應(yīng)：溶劑極性可增加或降低熒光強(qiáng)度〔改變—*及n—*躍遷的能量〕；與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強(qiáng)度。影響熒光的外界因素〔二〕溫度：溫度增加，熒光強(qiáng)度下降〔因?yàn)閮?nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性〞降低〕。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。影響熒光的外界因素〔三〕pH值：具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對(duì)無機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。pH<2pH>13pH7~12苯胺影響熒光的外界因素〔四〕內(nèi)濾光和自吸：體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光短波長與激發(fā)光長波長有重疊，均可使熒光強(qiáng)度下降，稱為內(nèi)濾光；當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，可吸收自身的熒光發(fā)射稱為熒光自吸。影響熒光的外界因素〔五〕熒光猝滅：碰撞猝滅；靜態(tài)猝滅；轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅；電子轉(zhuǎn)移猝滅；自猝滅。溶液的熒光熒光定量分析熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系F=FI0CLF—熒光效率—熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)I0—激發(fā)光強(qiáng)度L—液層厚度F=KC〔該式只有當(dāng)CL≤0.05時(shí)才成立〕熒光定量分析方法工作曲線法用F~C作圖比例法Fs－F0＝KCsFx－F0＝KCx儀器與技術(shù)熒光計(jì)的主要部件1〕光源：氙燈、高壓汞燈、激光；2〕樣品池：石英