果蠅精巢fasⅢ基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建畢業(yè)論文

果蠅精巢fasⅢ基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）原創(chuàng)性聲明和使用授權(quán)說明原創(chuàng)性聲明本人鄭重承諾：所呈交的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文），是我個(gè)人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的成果。盡我所知，除文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或組織已經(jīng)發(fā)表或公布過的研究成果，也不包含我為獲得及其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或?qū)W歷而使用過的材料。對(duì)本研究提供過幫助和做出過貢獻(xiàn)的個(gè)人或集體，均已在文中作了明確的說明并表示了謝意。作者簽名：日期：指導(dǎo)教師簽名：日期：使用授權(quán)說明本人完全了解大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的規(guī)定，即：按照學(xué)校要求提交畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務(wù)；學(xué)校可以采用影印、縮印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學(xué)?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉績?nèi)容。作者簽名：日期：

學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名： 日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。涉密論文按學(xué)校規(guī)定處理。作者簽名： 日期：年月日導(dǎo)師簽名：日期：年月日

注意事項(xiàng)1.設(shè)計(jì)（論文）的內(nèi)容包括：1）封面（按教務(wù)處制定的標(biāo)準(zhǔn)封面格式制作）2）原創(chuàng)性聲明3）中文摘要（300字左右）、關(guān)鍵詞4）外文摘要、關(guān)鍵詞5）目次頁（附件不統(tǒng)一編入）6）論文主體部分：引言（或緒論）、正文、結(jié)論7）參考文獻(xiàn)8）致謝9）附錄（對(duì)論文支持必要時(shí)）2.論文字?jǐn)?shù)要求：理工類設(shè)計(jì)（論文）正文字?jǐn)?shù)不少于1萬字（不包括圖紙、程序清單等），文科類論文正文字?jǐn)?shù)不少于1.2萬字。3.附件包括：任務(wù)書、開題報(bào)告、外文譯文、譯文原文（復(fù)印件）。4.文字、圖表要求：1）文字通順，語言流暢，書寫字跡工整，打印字體及大小符合要求，無錯(cuò)別字，不準(zhǔn)請(qǐng)他人代寫2）工程設(shè)計(jì)類題目的圖紙，要求部分用尺規(guī)繪制，部分用計(jì)算機(jī)繪制，所有圖紙應(yīng)符合國家技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。圖表整潔，布局合理，文字注釋必須使用工程字書寫，不準(zhǔn)用徒手畫3）畢業(yè)論文須用A4單面打印，論文50頁以上的雙面打印4）圖表應(yīng)繪制于無格子的頁面上5）軟件工程類課題應(yīng)有程序清單，并提供電子文檔5.裝訂順序1）設(shè)計(jì)（論文）2）附件：按照任務(wù)書、開題報(bào)告、外文譯文、譯文原文（復(fù)印件）次序裝訂

指導(dǎo)教師評(píng)閱書指導(dǎo)教師評(píng)價(jià)：一、撰寫（設(shè)計(jì)）過程1、學(xué)生在論文（設(shè)計(jì)）過程中的治學(xué)態(tài)度、工作精神□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、學(xué)生掌握專業(yè)知識(shí)、技能的扎實(shí)程度□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)和專業(yè)技能分析和解決問題的能力□優(yōu)□良□中□及格□不及格4、研究方法的科學(xué)性；技術(shù)線路的可行性；設(shè)計(jì)方案的合理性□優(yōu)□良□中□及格□不及格5、完成畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）期間的出勤情況□優(yōu)□良□中□及格□不及格二、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量1、論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫規(guī)范？□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？□優(yōu)□良□中□及格□不及格三、論文（設(shè)計(jì)）水平1、論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問題的指導(dǎo)意義□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、論文（設(shè)計(jì)說明書）所體現(xiàn)的整體水平□優(yōu)□良□中□及格□不及格建議成績：□優(yōu)□良□中□及格□不及格（在所選等級(jí)前的□內(nèi)畫“√”）指導(dǎo)教師：（簽名）單位：（蓋章）年月日

評(píng)閱教師評(píng)閱書評(píng)閱教師評(píng)價(jià)：一、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量1、論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫規(guī)范？□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？□優(yōu)□良□中□及格□不及格二、論文（設(shè)計(jì)）水平1、論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問題的指導(dǎo)意義□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、論文（設(shè)計(jì)說明書）所體現(xiàn)的整體水平□優(yōu)□良□中□及格□不及格建議成績：□優(yōu)□良□中□及格□不及格（在所選等級(jí)前的□內(nèi)畫“√”）評(píng)閱教師：（簽名）單位：（蓋章）年月日教研室（或答辯小組）及教學(xué)系意見教研室（或答辯小組）評(píng)價(jià)：一、答辯過程1、畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）的基本要點(diǎn)和見解的敘述情況□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、對(duì)答辯問題的反應(yīng)、理解、表達(dá)情況□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、學(xué)生答辯過程中的精神狀態(tài)□優(yōu)□良□中□及格□不及格二、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量1、論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫規(guī)范？□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？□優(yōu)□良□中□及格□不及格三、論文（設(shè)計(jì)）水平1、論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問題的指導(dǎo)意義□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、論文（設(shè)計(jì)說明書）所體現(xiàn)的整體水平□優(yōu)□良□中□及格□不及格評(píng)定成績：□優(yōu)□良□中□及格□不及格教研室主任（或答辯小組組長）：（簽名）年月日教學(xué)系意見：系主任：（簽名）年月日摘要：果蠅fasⅢ基因是蛋白編碼類基因，在精巢中fasⅢ基因主要在hubcell中表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基因克隆技術(shù)，以PET28a質(zhì)粒為載體，選用BamHI、HindⅢ兩種酶做雙酶切，將目的基因fasⅢ導(dǎo)入質(zhì)粒載體PET28a，從而構(gòu)建原核表達(dá)載體PET28a-fasⅢ，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，實(shí)現(xiàn)fasⅢ基因的原核表達(dá)。實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒載體用卡那抗性（Kanr）標(biāo)記，只有轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌才能在涂有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長。最終目的是實(shí)現(xiàn)fasⅢ蛋白的原核表達(dá)與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：基因克??；fasⅢ基因；原核表達(dá)載體；原核表達(dá)；TheconstructionoffasIIIprokaryoticexpressionvectorsziweiFei，CollegeoflifescienceAbstract:DrosophilaFasgeneisproteincodinggeneintestis,mainlyexpressedinhubcell.Inthisexperiment,bymeansofgenecloningtechnique,thetargetgeneFasIIIwasinsertedintotheplasmidvectorPET28awhichwasdigestedbytwoenzymesofBamHIandHindⅢ.soastoconstructtheprokaryoticexpressionvectorPET28a-fasⅢ,thentherecombinantplasmidwastransformedintoEscherichiacoliTOP10,achieveFasIIIgeneprokaryoticexpression.Theplasmidvectorwasmarkedwithkanamycinresistant(Kanr),OnlywastransformedsuccessfullyEscherichiacolicangrowinLBmediumwhichwascoatedwithkanamycin.TheultimateaimistorealizetheprokaryoticexpressionandpurificationofFasIIIprotein,forthefuturelaythefoundationforpreparingpolyclonalantibody.Keywords:Genecloning；fasⅢ；theprokaryoticexpressionvector；prokaryoticexpression；1前言1.1果蠅精巢的基本特征有兩個(gè)精巢，形狀為長而卷曲狀的管狀，圖示1-2[3]顯示出了精巢前端的結(jié)構(gòu)。精巢里有兩類干細(xì)胞:生殖干細(xì)胞GSC和體節(jié)干細(xì)胞SSC。GSC有7-9個(gè)，位于精巢的頂端，與Hubcell（HC）直接接觸，HC是精巢GSC微環(huán)境的重要組成部分[4]，SSC包裹在GSC周圍，和HC共同構(gòu)成了GSC的“niche”[5]。同卵巢GSCs一樣,精巢的GSCs也通過不對(duì)稱分裂產(chǎn)生2個(gè)子代細(xì)胞，一個(gè)仍然處于微環(huán)境中，與HC直接接觸，成為新的GSC，另一個(gè)遠(yuǎn)離微環(huán)境，發(fā)育為GB（gonialblast）細(xì)胞，走向分化。GB細(xì)胞經(jīng)四次胞質(zhì)不完全分裂形成一個(gè)16cell相連的合胞體。Fusome在GB中是圓形的，在分化的合胞體呈分支狀。每個(gè)GB或合胞體都被兩個(gè)SCCs圍繞著，持續(xù)調(diào)控它們的分化。圖1-2精巢前端的結(jié)構(gòu)Fig.1-2Theleading-endstructureoftesis1.2fasⅢ基因干細(xì)胞研究是目前國際研究前沿的熱點(diǎn)之一，生殖干細(xì)胞GSC的研究對(duì)于干細(xì)胞維持與分化等領(lǐng)域，以及生殖醫(yī)學(xué)及其相關(guān)疾病等的治療都將提供有價(jià)值的資料。果蠅具有繁殖周期短、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單、擁有成熟的遺傳分析手段及豐富的遺傳學(xué)資源等特點(diǎn)；同時(shí)鑒于果蠅生殖干細(xì)胞分裂和分化發(fā)育過程中的細(xì)胞譜系都研究得很清楚，故果蠅的精巢和卵巢是細(xì)胞和分子水平上研究干細(xì)胞生物學(xué)的理想系統(tǒng)。fasⅢ基因是蛋白編碼類基因，具有七個(gè)轉(zhuǎn)錄本，最早發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細(xì)胞中，功能是以Ca2+獨(dú)立的方式介導(dǎo)細(xì)胞粘附，在軸突發(fā)展、指導(dǎo)和束狀的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展發(fā)揮作用。果蠅精巢中fasⅢ基因主要在hubcell中表達(dá)[1]，利用fasIII基因的表達(dá)蛋白制備多克隆抗體，進(jìn)行抗原抗體免疫熒光反應(yīng)，可以確定Hub細(xì)胞的位置[2]，從而有利于對(duì)果蠅精巢干細(xì)胞的研究。1.3載體（Vectors）廣義上通常把能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具叫載體。在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體[6]。1、基因工程對(duì)載體的要求：（1）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，可提高載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率。（2）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制原點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使得外源基因可在受體細(xì)胞中大量繁殖或穩(wěn)定遺傳。（3）具有多種單一的核酸酶切位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))，可用于外源基因的插入，同時(shí)不影響載體的擴(kuò)增和繁殖。（4）具有合適的選擇標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測。（5）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移，避免基因的非控制性擴(kuò)散，給人類造成危害。本實(shí)驗(yàn)選用的PET28a為質(zhì)粒載體，長度為5369bp。1.4抗菌素的抗性工作原理卡那霉素（kanamycin，Kan）殺菌原理：通過與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀。殺死細(xì)菌。細(xì)菌抗性原理：Kanr編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。2實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器表2.1實(shí)驗(yàn)儀器及廠家Table2.1Experimentalinstrumentsandmanufacturers儀器名稱nameofapparatus生產(chǎn)廠家manufacturers恒溫水浴鍋HH-2江蘇金壇市宏華儀器廠雙人單面凈化工作臺(tái)SW-CJ-2FD蘇州凈化設(shè)備有限公司高速冷凍離心機(jī)EppendorfDNA擴(kuò)增儀Lcycler電熱恒溫培養(yǎng)箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠氣浴恒溫振蕩器SH2-82A金壇市宏華儀器廠智能電熱鼓風(fēng)干燥箱上海成順儀器儀表有限公司2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑限制性核酸內(nèi)切酶：BamHIHindⅢ10×KBuffer通用BufferBSAprimerSTARMAXpremixcDNA模板CIAP堿性磷酸酶瓊脂糖1×TAE緩沖液溴化乙錠溶液EBDNA分子量Marker15kb10×loadingbuffer5MNacl苯酚、氯仿無水乙醇75%乙醇溶液T4DNA連接酶10×T4DNAligasebufferInoue轉(zhuǎn)化緩沖液DMSO二甲亞礬LB液體培養(yǎng)基試劑盒：瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）2.1.3引物本實(shí)驗(yàn)所用的擴(kuò)增引物和測序序列均由生工生物工程上海有限公司合成部合成。引物片段：Fas-bamH/F：ataggatccCTCCTCAACGAAGGCATCGFas-Hind/R：ataaagcttctaGAGGCTGCTGCTGGGCGGTTTG2.1.4質(zhì)粒載體本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒載體PET28a來自于本實(shí)驗(yàn)室保存。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1目的基因的獲取1、PCR反應(yīng)體系表2.1PCR反應(yīng)體系150μlTable2.1PCRreactionsystem(150μl)反應(yīng)組分體積2×primerSTARMAXpremix75.0μl上游引物fasⅢ-bamH/F1.5μl下游引物fasⅢ-Hind/R1.5μlcDNA模板6.0μlddH2O66.0μl2、PCR反應(yīng)程序98℃5min98℃20s30cycles55℃20s72℃1min30s72℃5min16℃4min3、瓊脂糖凝膠電泳檢測（1）制備0.1％瓊脂糖凝膠：稱取0.25g瓊脂糖，加入25ml1×TAE緩沖液，置微波爐加熱至完全融化，取出搖勻。（2）膠板的制備：將塑料內(nèi)槽洗凈、晾干，放置于水平制膠器中，并放好樣品梳；待膠液冷到60℃左右時(shí)，加入2—3μl的溴化乙錠，輕輕混勻后將膠液倒入塑料內(nèi)槽，至塑料板上形成一層膠面；待膠液凝固后，將梳子輕輕垂直拔出；將塑料內(nèi)槽取出放入電泳槽內(nèi)，并加入1×TAE緩沖液至電泳槽中使緩沖液浸沒膠面，高出凝膠。（3）加樣：取約2μl10×loadingbuffer與2μlPCR產(chǎn)物混合均勻，用移液槍加到凝膠孔中，并用DL15000TMDNAMaker做對(duì)照。（4）電泳：蓋好電泳槽蓋子，接通電泳槽與電泳儀的電源，選擇電泳電壓120V，開始電泳。（5）觀察結(jié)果：取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像，根據(jù)片段大小判斷目的片段是否擴(kuò)增成功。2.2.2酶切1、DNA產(chǎn)物的純化產(chǎn)物共150μL，集中到1.5mLEP管，加無菌水至500μL（1）酚抽：在EP管中加入等體積，即500μL苯酚/氯仿混合液，顛倒混勻，室溫12000r/min離心5min，吸取上層液到新的EP管，吸約450μL（2）加入1/10體積的5MNaCl（按450uL換算，即45μLNaCl）（3）加入2-3倍體積無水乙醇1mL，混勻，4℃12000r/min離心10min，吸走上清液，產(chǎn)物沉淀在底部。（4）漂洗：用70%乙醇清洗沉淀1-2次，離心，徹底吸走上清液。（5）干燥和溶解：自然干燥5min至殘留乙醇揮發(fā)干凈，加入20μL無菌水溶解。2、酶切，體系如表2.2所示表2.2酶切體系50μlTable2.2Enzymedigestionsystem(50μl)反應(yīng)組分體積無菌水18.0μlBSA5.0μl10×K.Buffer5.0μlBamHI1.0μlHindⅢ1.0μl質(zhì)粒或片段20.0μl溶液配好混勻后瞬時(shí)離心，使溶液集中于管底，放在37℃水浴鍋水浴1h；其中PET28a質(zhì)粒酶切管在水浴1h后需加入1μlCIAP，接著水浴30min。2.2.3瓊脂糖凝膠電泳法回收DNA制膠切膠瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作步驟（1）柱平衡步驟：向吸附柱CA2中加入500μl平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（2）將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的離心管中，稱取重量。（3）向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，50℃水浴放置10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。（4）將上一步所得的溶液加入一個(gè)吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。（5）將吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。（6）重復(fù)操作步驟5（7）將吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm離心2min，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。（8）將吸附柱CA2放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min。12000rpm離心2min收集DNA溶液。（9）電泳檢測：分別取3μl酶切樣品與2μl10×loadingbuffer混合后加到凝膠孔中開始電泳，電泳結(jié)束后取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像。2.2.4DNA片段的體外連接(目的基因?qū)胭|(zhì)粒載體)1、配制連接體系，各成分如表2.3所示，體系中外源基因量要多些，載體的量要少些；表2.3連接體系10μlTable2.2Connectionsystem(10μl)反應(yīng)組分體積10×T4DNAligaseBuffer1.0μlT4DNAligase0.8μl酶切的PET28a質(zhì)粒3.0μl酶切的fasⅢ片段5.2μl2、混勻后用瞬時(shí)離心，使液體全部集中于管底；3、將離心管放于16℃水浴鍋保溫過夜；4、取出連接體系，利用感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。2.2.5連接體系的轉(zhuǎn)化取1管100μl的TOP10超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，在冰上化凍后，在無菌操作臺(tái)里向EP管中加入7μl連接體系，用槍輕輕吹打混勻；將EP管插在冰水復(fù)合物中冰浴30min；將EP管放到42℃恒溫水浴鍋中保溫90s，然后迅速放到冰水復(fù)合物中冰浴2min；在無菌操作臺(tái)里向EP管中加入1ml的含K的液體LB培養(yǎng)液，混勻后放于搖床上37℃振蕩培養(yǎng)45min，轉(zhuǎn)速為150rpm/min，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)；45min之后，3000r/min離心3min在無菌操作臺(tái)中棄去950μl上清液，余下的150μl用移液槍輕輕打勻，吸至含K的LB培養(yǎng)基平板中，用事先已經(jīng)加熱滅菌并冷卻后的三角推棒輕輕涂布均勻；待涂布液干燥后，將平板37℃培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)。2.2.6挑菌落做菌落PCR1、PCR反應(yīng)體系表2.4PCR反應(yīng)體系25μlTable2.4PCRreactionsystem(25μl)反應(yīng)組分體積10×PCRBuffer2.5μldNTP0.25μl上游引物fasⅢ-bamH/F0.25μl下游引物fasⅢ-Hind/R0.25μlrTaq酶0.25μl模板ddH2O21.5μl模板：陽性對(duì)照—重組質(zhì)粒的連接體系陰性對(duì)照—無菌水實(shí)驗(yàn)組—待檢測的菌落PCR反應(yīng)程序97℃3min94℃30s30cycles52℃30s72℃1min72℃3min16℃3min瓊脂糖凝膠電泳檢測：以DNAMamker和陽性對(duì)照作參考，判斷實(shí)驗(yàn)組條帶大小是否正確，進(jìn)而判斷是否為陽性克隆。2.2.7重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)管培養(yǎng)經(jīng)過菌落PCR鑒定后，挑選4個(gè)初步鑒定是陽性克隆的菌落轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。將無菌操作臺(tái)滅菌后，取4個(gè)15mlEP管，分別加入約4ml含卡那霉素（Kan）的LB液體培養(yǎng)基。用無菌槍頭挑取單菌落，在EP管的培養(yǎng)基中輕輕攪拌，并將槍頭打入EP管中，蓋緊管蓋，放于搖床上37℃振蕩培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)速為180rpm/min。2.2.8PET28a-fasⅢ質(zhì)粒的少量制備菌液保種：將選取的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，渾濁后分別取450μl菌液并各加入50μlDMSO于-20℃凍存。用質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）提取并制備質(zhì)粒。操作步驟：柱平衡步驟：向吸附柱CP3中加入500μl平衡液BL，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。取1.5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12000rpm離心1min，盡量吸除上清。向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1（使用前已加入RNaseA）,用移液槍徹底懸浮細(xì)菌沉淀。向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解，所用時(shí)間不超過5分鐘。向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min。將上一步收集的上清液用移液槍轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，盡量不要吸出沉淀。12000rpm離心30sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放回收集管中。重復(fù)操作步驟（8）將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心1min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱CP3置于一個(gè)感覺離心管中，向吸附膜中間部位滴加70μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。離心管中收集制備好的質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測：分別取3μl提取的質(zhì)粒DNA樣品與2μl10×loadingbuffer混合后加到凝膠孔中開始電泳，電泳結(jié)束后取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像，根據(jù)片段大小判斷質(zhì)粒是否制備成功。2.2.9重組質(zhì)粒雙酶切鑒定1、酶切體系如表2.5所示表2.5酶切體系30μlTable2.5Enzymedigestionsystem(30μl)反應(yīng)組分體積無菌水4.0μlBSA3.0μl10×K.Buffer3.0μlBamHI1.0μlHindⅢ1.0μl質(zhì)粒或片段18.0μl溶液配好混勻后瞬時(shí)離心，使溶液集中于管底，放在37℃水浴鍋水浴1.5h；2、瓊脂糖凝膠電泳檢測：將所有雙酶切產(chǎn)物與2μl10×loadingbuffer混合后加到凝膠孔中開始電泳，電泳結(jié)束后取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像。以15kbDNAMamker作參考，判斷實(shí)驗(yàn)組條帶大小是否正確。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1目的基因PCR12M1000bp瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結(jié)果如下圖3-1所示，本實(shí)驗(yàn)所用DNAMarker為15000bp，DNAMarker：250-1000-5000-7500-10000-15000。目的基因fasⅢ為950bp,與Marker第二條帶（1000bp）基本對(duì)應(yīng)。說明PCR產(chǎn)物為目的基因fasⅢ12M1000bp圖3-1目的基因fasⅢ的PCR鑒定Fig.3-1IdentificationofPCRgeneFasIII1，2；目的基因片段M,DNAMarker；3.2質(zhì)粒和目的基因片段酶切反應(yīng)1M25369bp1000bp瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結(jié)果如下圖3-2所示，實(shí)驗(yàn)所用1M25369bp1000bp圖3-2目的基因片段與質(zhì)粒酶切反應(yīng)后鑒定Fig.3-2Theidentificationoftargetgenefragmentandtheplasmid1，目的基因fasⅢ的酶切結(jié)果；M，DNAMarker；2，質(zhì)粒PET28a酶切結(jié)果；3.3瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA1M21000bp1M21000bp5369bp圖3-3DNA回收后鑒定Fig.3-3TheidentificationofDNArecovery1，質(zhì)粒PET28a；2，目的基因fasⅢ；M，DNAMarker；3.4菌落PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測：以DNAMamker(15000bp)和陽性對(duì)照作參考，其中,4是陽性對(duì)照，M是DNAMamker，1，2，3，5，為菌落PCR產(chǎn)物，條帶清晰明亮，與陽性對(duì)照的條帶大小一致，說明是陽性克隆。12312345M1000bp圖3-4菌落PCR的鑒定Fig.3-4TheidentificationofcolonyPCR1，2，3，5，菌落PCR產(chǎn)物；4，陽性對(duì)照；M，DNAMarker；3.5質(zhì)粒制備的鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結(jié)果如下圖3-5所示，制備目的基因fasⅢ與PET28a的重組質(zhì)粒，片段大小約6000bp，以DNAMamker(15000bp)作參考，位于Marker第三條帶（5000bp）和第四條帶（7500bp）之間。其中1,2,3,分別對(duì)應(yīng)EP管上編號(hào)為3,4,10。123M7500bp5000bp5000bp圖3-5質(zhì)粒制備的鑒定Fig.3-5TheIdentificationofplasmidM，DNAMarker；1,2,3,重組質(zhì)粒；3.6重組質(zhì)粒雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結(jié)果如下圖3-6所示，雙酶切后的產(chǎn)物為兩條帶，分別是目的基因fasⅢ片段與質(zhì)粒PET28a片段，其中目的基因片段與DNAMarker(15000bp)第一條帶對(duì)應(yīng)，質(zhì)粒PET28a片段與DNAMarker第四條帶對(duì)應(yīng)，1，2，3，分別對(duì)應(yīng)EP管上編號(hào)為3，4，1012M312M35369bp1000bp圖3-6重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3-６Therecombinantplasmidwasidentifiedbydoubleenzymedigestion1，2，3，雙酶切產(chǎn)物；M，DNAMarker；四、討論實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了果蠅精巢fasⅢ基因原核表達(dá)載體，最終目的是實(shí)現(xiàn)fasⅢ蛋白的原核表達(dá)與純化，為以后制備多克隆抗體奠定基礎(chǔ)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還需將重組載體導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21，實(shí)現(xiàn)fasⅢ基因的高效表達(dá)，并通過鎳瓊脂糖凝膠層析法純化標(biāo)記蛋白。利用fasⅢ表達(dá)蛋白制備多克隆抗體，可用于抗原抗體免疫熒光反應(yīng)，從而標(biāo)記hubcell的位置，更利于了解和研究果蠅精巢結(jié)構(gòu)。參考文獻(xiàn)：[1]PeterM.Snow,AllanJ.Bieber,andCoreyS.GoodmanFasciclinIII:ANovelHomophilicAdhesionMoleculeinDrosophila.Cel[J],1989:313-323.[2]EihachiroKawase1,MarcoD.Wong1,BeeC.Ding1andTingXie,Gbb/BmpsignalingisessentialformaintaininggermlinestemcellsandforrepressingbamtranscriptionintheDrosophilatestis.TheCompanyofBiologists[J],2004,131(59):1365-1375.[3]Kawase,E.etal.Gbb/bmpsignalingisessentialformaintaininggermlinestemcellsandforrepressingbamtranscriptionintheDrosophilatestis.Development[J],2004.131(6):1365-1375.[4]Yamashita,Y.M.,M.T.Fuller,andD.L.Jones.Signalinginstemcellniches:lessonsfromtheDrosophilagermline.JournalofcellScience[J],2005.118(4):665-672.[5]Decotto,E.andA.C.Spradling.TheDrosophilaovarianandtestisstemcellniches:similarsomaticstemcellandsignals.Developmentalcell[J],2005.9(4):501-510.[6]劉祥林，聶劉旺.基因工程[B].科學(xué)出版社，2005：59-98.致謝時(shí)光荏苒，歲月如梭。轉(zhuǎn)眼間美好的大學(xué)四年生活已經(jīng)接近了尾聲，經(jīng)過四年的學(xué)習(xí)我在各個(gè)方面都有所提高。生命不止，奮斗不息。大學(xué)生活的結(jié)束，意味著我要踏上新的征程，再次揚(yáng)帆起航。經(jīng)過多天的努力，逐漸完成了本科畢業(yè)論文的實(shí)驗(yàn)操作部分和寫作部分。這次的經(jīng)歷讓我受益匪淺，同時(shí)也暴露出我在多方面的不足與缺陷。從開始不熟練的實(shí)驗(yàn)操作到最后的獨(dú)立完成，從開始寫論文時(shí)的無從下手到最后的游刃有余，這一點(diǎn)一滴的進(jìn)步都是在和同學(xué)的互幫互助以及老師的耐心指導(dǎo)下取得的。在論文實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和寫作過程中，我得到了陳冬生老師極大地幫助和耐心的指導(dǎo)。從課題的選擇、實(shí)驗(yàn)操作到項(xiàng)目的最終完成，陳老師始終耐心在一旁給于指導(dǎo)，在實(shí)驗(yàn)的過程之中，耐心的幫我解決遇到的問題，每個(gè)步驟都力爭做到最好。在論文初稿到成稿的過程之中，不厭其煩的為我修改。陳老師嚴(yán)肅的科學(xué)態(tài)度，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)精神，精益求精的工作作風(fēng)，深深地感染和激勵(lì)著我并將積極影響我今后的學(xué)習(xí)和工作。陳老師是我的良師，不僅在畢業(yè)論文期間給力我很大的幫助，同時(shí)在我考研期間也給了我很多寶貴的意見。在此謹(jǐn)向陳老師致以崇高的敬意和誠摯的謝意，愿您一生幸福，安康！感謝實(shí)驗(yàn)室所有成員：師姐朱翔翔、王雙，師兄王劍；同窗潘慧敏，曹治杰，李國芳。感謝你們的陪伴與幫助，尤其感謝師姐師兄對(duì)我的耐心指導(dǎo)和悉心解說，給予我很大的幫助，讓我受益匪淺，在這里請(qǐng)接受我誠摯的謝意。

最后，我要感謝我的母校——安徽師范大學(xué)和生命科學(xué)學(xué)院在這四年來對(duì)我的精心栽培。還有我的爸爸媽媽，姑姑、舅舅對(duì)我生活方方面面的關(guān)心，你們是我堅(jiān)強(qiáng)的后盾，是我溫馨的港灣，愿你們一生平安幸福！費(fèi)紫薇2015年4月目錄TOC\o"1-3"\h\u19576摘要 1233921前言 24471.1果蠅精巢的基本特征 2252991.2fasⅢ基因 268311.3載體 368481.4抗菌素的抗性工作原理 3145472實(shí)驗(yàn)材料與方法 310812.1實(shí)驗(yàn)材料 3286302.1.1實(shí)驗(yàn)儀器 3183022.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 495292.1.3引物 53552.1.4質(zhì)粒載體 5252222.2實(shí)驗(yàn)方法 574612.2.1目的基因的獲取 5221162.2.2酶切 696692.2.3瓊脂糖凝膠電泳法回收DNA 7253322.2.4DNA片段的體外連接(目的基因?qū)胭|(zhì)粒載體) 749612.2.5連接體系的轉(zhuǎn)化 8195462.2.6挑菌落做菌落PCR 8317772.2.7重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)管培養(yǎng) 9287772.2.8PET28a-fasⅢ質(zhì)粒的少量制備 935002.2.9重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 1030915三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 1169893.1目的基因PCR 11171383.2質(zhì)粒和目的基因片段酶切反應(yīng) 12118173.3瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA 12220793.4菌落PCR鑒定 12123423.5質(zhì)粒制備的鑒定 13157043.6重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 1320432四、討論 142557參考文獻(xiàn) 1426917致謝 1580196單片機(jī)IP研究與實(shí)現(xiàn),TN914.42AT89S52單片機(jī)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的開發(fā)與應(yīng)用,TG155.1F406基于單片機(jī)的LED三維動(dòng)態(tài)信息顯示系統(tǒng),O536TG174.444基于單片機(jī)的IGBT光伏充電控制器的研究,TV732.1TV312基于89C52單片機(jī)的印刷品色彩質(zhì)量檢測系統(tǒng)的研究,TP391.41基于單片機(jī)+CPLD體系結(jié)構(gòu)的信標(biāo)機(jī)設(shè)計(jì),TU858.3TN915.62基于單片機(jī)SPCE061A的汽車空調(diào)控制系統(tǒng),TM774TM621.3帶有IEEE488接口的通用單片機(jī)系統(tǒng)方案設(shè)計(jì)與研究,TN015基于VC的單片機(jī)軟件式開發(fā)平臺(tái),TG155.1F406基于VB的單片機(jī)虛擬實(shí)驗(yàn)軟件的研究與開發(fā),TG155.1F406采用單片機(jī)的電阻點(diǎn)焊智能控制器開發(fā),TG155.1F406基于51系列單片機(jī)的PROFIBUS-DP智能從站研究,TG155.1F406八位單片機(jī)以太網(wǎng)接入研究與實(shí)現(xiàn),TG155.1F406基于單片機(jī)與Internet的數(shù)控機(jī)床遠(yuǎn)程監(jiān)控系統(tǒng)的研發(fā),R319TP319基于單片機(jī)和DSP控制的醫(yī)用輸液泵的研究,U467.11基于單片機(jī)控制新型逆變穩(wěn)壓電源的設(shè)計(jì)與仿真,F426.22TP311.52基于8位單片機(jī)的摩托車發(fā)動(dòng)機(jī)電控單元軟硬件的開發(fā),TB61基于430單片機(jī)的變壓器監(jiān)控終端的研究,TG155.1F406逆變點(diǎn)焊單片機(jī)控制系統(tǒng)研究,TG131TG113.14單片機(jī)控制數(shù)字變量柱塞泵的研究,F426.22TP311.52基于單片機(jī)控制的高通量藥物篩選及檢測系統(tǒng)開發(fā),R730.55R734.2MCS8051以及DS80C320單片機(jī)軟核的設(shè)計(jì),TP391基于AVR單片機(jī)的應(yīng)用設(shè)計(jì)實(shí)踐,TN015LPC2210單片機(jī)