膠團反膠團萃取

關于膠團反膠團萃取第1頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三目錄一、膠團與反膠團概述二、反膠團的物理化學特性及制備三、反膠團萃取機理四、在分離工藝中的應用第2頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

一、膠團與反膠團概述1、膠團的形成及特性2、反膠團的形成及特性3、表面活性劑4、反膠團的分類

第3頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

1、膠團的形成及特性

膠團或反膠團的形成均是表面活性劑分子自聚的結果，是熱力學穩(wěn)定體系。將表面活性劑溶于水中，當其濃度超過臨界膠團濃度（criticalmicelleconcentration,CMC）時，表面活性劑就會在水溶液中聚集在一起形成聚集體，稱為膠團（micelles）。特性：水溶液中膠團的表面活性劑的極性基團向外與水相接觸，而非極性基團在內，形成一個非極性的核心，此核心可以溶解非極性物質。

第4頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三極性“頭”水非極性的“核”非極性“尾”正膠團：表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內，中間形成非極性的“核”第5頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三2、反膠團的形成及特性

若有機溶劑中加入表面活性劑，當其濃度超過臨界濃度時，就會在有機相中也形成聚集體，稱為反膠團。在反膠團中，表面活性劑的非極性基團在外，與有機相接觸，而極性基團則排列在內形成一個極性核。

特性：此極性核具有溶解極性物質的能力，極性核溶解水后，就形成“水池”。由于周圍水層和極性基團的保護，保持了蛋白質的天然構型，不會造成失活。第6頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三極性“頭”有機溶劑極性的“核”非極性“尾”反膠團：表面活性劑的極性頭朝內，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”第7頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三3、表面活性劑

表面活性劑的存在是構成反膠團的必要條件，有三類表面活性劑都可在非極性溶劑中形成反膠團。（1）陰離子型表面活性劑（2）陽離子型表面活性劑（3）非離子型表面活性劑第8頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三常用的表面活性劑及其相應的有機溶劑第9頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

在反膠團萃取蛋白質使用最多的是陰離子型表面活性劑AOT，AOT容易獲得，它具有雙鏈，形成反膠團時無需添加輔助表面活性劑且有較好的強度；它的極性基團較小，所形成的反膠團空間較大，有利于生物大分子進入。第10頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三4、反膠團的分類1）單一表面活性劑反膠團體系：

是指在使用時無須加入助劑的表面活性劑，具有多條中等長度的烷基尾和一個較小的極性頭。

A、陰離子型，如AOT。該體系結構簡單和穩(wěn)定，反膠團體積較大，適用于等電點較高的、相對分子量較小的蛋白質的分離；

B、陽離子型，如CTAB，DAP等。該體系適用于等電點較低的、相對分子量較大的蛋白質的分離；

C、非離子型表面活性劑。能形成更大的反膠團體系，能分離相對分子量更大的蛋白質，但這類體系容易乳化。第11頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三2）混合表面活性劑反膠團體系：

是指兩種或兩種以上表面活性劑構成的體系，一般來說，混合表面活性劑反膠團對蛋白質有更高的分離效率。

3）親和反膠團體系：

是指除了有組成反膠團的表面活性劑以外，還有具有親和特征的助劑，它的親和配基與蛋白質有特異的結合能力，往往極少量親和配基的加入就可使萃取蛋白質的選擇性大大提高。第12頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三表面活性劑聚集體的可能的微觀構造第13頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三1、反膠團的物理化學特性影響反膠團的大小的因素：（1）表面活性劑和非極性有機溶劑的種類、濃度；（2）操作時體系的溫度、壓力；（3）微小水池中的離子強度等。二、反膠團的物理化學特性及制備第14頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三（1）反膠團的臨界膠團濃度表面活性劑在非極性有機溶劑相中能形成反膠團的最小濃度稱為臨界膠團濃度（CMC）。大多數(shù)在0.1~1.0mmol/L之間。CMC與表面活性劑的種類有關。

見下表第15頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三某些表面活性劑的臨界膠束濃度／(mol／L)第16頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三（2）反膠團含水率W：W用水和表面活性劑的摩爾濃度之比來定義：

C[水]

W=

C[表面活性劑]

如：表面活性劑是AOT，則W=

W越大，反膠團的半徑越大。C[AOT]C[水]第17頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

當W<6-8時，“水池”（微水相）中水分子被表面活性劑親水基團強烈地束縛，其表觀粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常強。另外，其冰點通常低于0℃。這一部分水使表面活性劑的親水性基團水合化，即被牢固地束縛著，所以粘度很大，流動性很差。第18頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

在AOT反膠團中，水合化一分子AOT需要6~8個水分子，而其它水分子則不受束縛，可與普通水一樣自由流動。故當W>16時，“水池”中的水逐漸接近主體水相粘度，膠團內也形成二重電荷層。

第19頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第20頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

假定反膠團為球形（除了W或表面活性劑濃度很大外），反膠團平均直徑dm的增加和W的增加基本成正比，W=0~50之間，dm=2~30nm。AOT的Wmax=60，若W值再增大，反膠團溶液變渾濁，并開始分層。第21頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三2、反膠團的制備制備反膠團系統(tǒng)一般有以下三種方法：（1）注入法

將含有蛋白質的水溶液直接注入到含有表面活性劑的非極性有機溶劑中去，然后進行攪拌直到形成透明的溶液為止。該方法過程快，并能較好地控制反膠團的平均直徑和含水量。第22頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三（2）相轉移法

將酶或蛋白質從主體水相轉移到含表面活性劑的非極性有機溶劑中形成反膠團-蛋白質溶液，即把含有表面活性劑的有機相和含有蛋白質的水相接觸，在緩慢的攪拌下，一部分蛋白質緩慢轉入（萃入）有機相。

該過程較慢，但形成的體系處于穩(wěn)定的熱力學平衡狀態(tài)，有利于在有機溶劑相中獲得較高的蛋白質濃度。第23頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三（3）溶解法

將含有反膠團（W＝3~30）的有機溶液與蛋白質固體粉末一齊攪拌，使蛋白質進入反膠團中。用于非水溶性蛋白質。該法所需時間較長，含蛋白質的反膠團體系穩(wěn)定。說明反膠團“水池”中的水與普通水的性質有區(qū)別。第24頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

三、反膠團萃取1.反膠團萃取原理2.反膠團萃取的優(yōu)點3.影響反膠團萃取生物分子的主要因素4.反膠團萃取幾種相互作用5.蛋白質的溶解模型第25頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三膠團萃?。╩icellarextrceion）是被萃取物以膠團或者膠體形式從水相被萃取到有機相的溶劑萃取方法，既可用于無機物的萃取，也可用于有機物的萃取。反膠團萃?。╮eversedmicellarextrceion）是利用表面活性劑在有機溶劑相中形成反膠團進行萃取，即反膠團在有機相內形成一個親水微環(huán)境，使蛋白質類生物活性物質溶解于其中，從而避免在有機相中發(fā)生不可逆變性的現(xiàn)象。第26頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三1、反膠團萃取原理

從宏觀上看反膠團萃取，是有機相－水相間的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微觀上，是從主體水相向溶解于有機溶劑相中的反膠團微水相中的分配萃取。從原理上，可當做“液膜”分離操作的一種。如下圖所示：第27頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第28頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三2、反膠團萃取的優(yōu)點①萃取率和反萃取率高，并具有選擇性；②分離、濃縮可同時進行，過程簡便；③能解決蛋白質(如胞內酶)在非細胞環(huán)境中迅速失活的問題；④由于構成反膠團的表面活性劑往往具有細胞破壁功效，因而可直接從完整細胞中提取具有活性的蛋白質和酶；⑤反膠團萃取技術的成本低，溶劑可反復使用等。第29頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三3、影響反膠團萃取生物分子的主要因素

（1）水相pH值的影響蛋白質是一種兩性電解質，水相的pH值決定了蛋白質分子表面可電離基團的離子化程度，當?shù)鞍踪|所帶電荷與反膠團內所帶電荷的性質相反時，由于靜電引力，可使蛋白質轉移到反膠團中。相反，當水相pH大于等電點時，由于靜電斥力，使溶入反膠團的蛋白質反向萃取出來，實現(xiàn)了蛋白質的反萃取。

第30頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三（2）水相離子強度的影響

a：離子強度影響到反膠團內壁的靜電屏蔽的程度，降低了蛋白質分子和反膠團內壁的靜電作用力。b：減小表面活性劑極性頭之間的相互斥力，使反膠團變小。這兩方面的效應都會使蛋白質分子的溶解性下降，甚至使已溶解的蛋白質從反膠團中反萃取出來。

第31頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三（3）助表面活性劑的影響

蛋白質的分子量往往很大，超過幾萬或幾十萬，使表面活性劑形成的反膠團的大小不足以包容大的蛋白質，而無法實現(xiàn)萃取，此時加入一些非離子表面活性劑，使它們插入反膠團結構中，就可以增大反膠團的尺寸，溶解相對分子質量較大的蛋白質。

第32頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

（4）溶劑體系的影響

溶劑的性質，尤其是極性，對反膠團的形成和大小都有影響。常用的溶劑有：烷烴類（正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷等）。有時也使用助溶劑，如醇類?？梢哉{節(jié)溶劑體系的極性，改變反膠團的大小，增加蛋白質的溶解度。第33頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三4、反膠團萃取相互作用因分離中使用的表面活性劑種類不同，如陰離子型和陽離子型，其相互作用和分離原理也會不同。以立體性、靜電性、疏水性相互作用的分離特性歸納如下：

第34頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三1）氨基酸分離特性

氨基酸分子量與反膠團相比太小，不存在反膠團-氨基酸分子間的立體性相互作用和分子間的大小識別。但由于氨基酸因pH不同而發(fā)生正負電荷的變化和帶有疏水性殘基，所以，以靜電和疏水性相互作用來定量評價氨基酸的萃取特性和效果。第35頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三如圖，平均每單位正電荷量、每分子AOT，萃入的氨基酸分子數(shù)是一固定值，該值由氨基酸種類決定。氨基酸殘基的疏水性越大，該值越大。第36頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三2）酶、蛋白質萃取特性

酶、蛋白質等生物大分子的空間尺度與反膠團的大小相接近，故存在立體性相互作用。各種相互作用都很重要，在大多數(shù)情況下，是它們之間的復合作用。有些蛋白質的構象發(fā)生很小的變化時，就可能對這些相互作用的結果產生很大影響。第37頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三（1）靜電性相互作用第38頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

①小分子蛋白質（Mr<20000）當pH>pI時，蛋白質不能溶入膠團內，但在等電點附近，急速變?yōu)榭扇堋?/p>

當pH<pI時，即在蛋白質帶正電荷的pH范圍內，它們幾乎完全溶入膠團內。第39頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

②蛋白質分子量增大到一定程度，即使將pH向酸性一側偏離pI，萃取率也會降低（即立體性相互作用效果增大）。

③分子量更大的BSA，全pH范圍內幾乎都不能萃?。挫o電相互作用效果無限小，可忽略不計）。此時，AOT濃度如從通常條件（50~100mmol/L）增加到200~500mmol/L，逐漸變?yōu)榭奢腿　５?0頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三④降低pH，正電荷量增加，萃取率從某一pH開始，急速減小。這是因為pH導致蛋白質變性造成的。蛋白質和微量的AOT在靜電、疏水性等的相互作用下，在水相中形成了復合體而變性。第41頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三⑤添加KCl等無機鹽，因離子強度的增加和靜電屏蔽的作用，而使靜電性相互作用變弱，一般地，萃取率下降。第42頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三（2）立體性相互作用（空間位阻）隨蛋白質分子量的增大，蛋白質分子和膠團間的立體性相互作用增加，萃取率下降。第43頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三萃取溶入膠團的蛋白質的種類和分子量不同，對分離場的特性（膠團平均直徑和含水率）影響很小。隨著蛋白質分子量的增加，分配系數(shù)KpI（蛋白質等電點處的分配系數(shù)）迅速下降。可以認為相對分子量20000左右的蛋白質的高效分離是通過立體性相互作用來實現(xiàn)的。第44頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三（3）其它的相互作用

關于疏水性相互作用和特異性相互作用，還研究不多。一般認為疏水性相互作用對蛋白質分配特性的影響不大。第45頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質向非極性溶劑中反膠團的納米級水池中的溶解，有下圖所示的四種可能。（1）為水殼模型；（2）蛋白質中的親脂部分直接與非極性溶劑的碳氫化合物相接觸；（3）蛋白質被吸附在微膠團的“內壁”上；（4）蛋白質被幾個微膠團所溶解，微膠團的非極性尾端與蛋白質的親脂部分直接作用。5、蛋白質的溶解模型第46頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第47頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

在水殼模型中，蛋白質居于“水池”的中心，水殼層保護了蛋白質，使它的生物活性不會改變。蛋白質表面電荷與反膠團內表面電荷間的靜電作用是使蛋白質進入反膠團的重要因素，因此凡能影響靜電作用的因素都會影響蛋白質的溶入，如水溶液的pH、離子強度等。第48頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三四、在分離工藝中的應用

1、蛋白質分離

利用靜電相互作用，通過三步分離核糖核酸a、細胞色素c和溶菌酶。調整pH，進行正萃取分離，通過控制KCl濃度，反萃取分離，獲得較好地分離效果和收率。第49頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第50頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三

第一步：在pH=9.0和較低的鹽濃度下，核糖核酸酶a帶負電荷，不能被反膠團萃取，留在水相中，而細胞色素C和溶菌酶由于都帶正電荷，被萃取到反膠團中。第二步：利用提高離子強度，將