食品酶學(xué)課件本第三章酶的分離純化第四節(jié)分離方法

第三章酶的分離純化概述第一節(jié)起始材料的選擇第二節(jié)細(xì)胞破碎第三節(jié)酶的提取第四節(jié)分離方法第五節(jié)酶純化步驟的設(shè)計(jì)及純化效果的定量評價(jià)復(fù)習(xí)題7/3/20231分離方法分述一、離心分離法二、過濾與膜分離三、沉淀分離法四、層析分離法五、電泳分離法六、酶的結(jié)晶七、濃縮與干燥7/3/20232四、層析分離法原理：利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差別，使各組分不同程度地分布在固定相和流動(dòng)相中，當(dāng)流動(dòng)相經(jīng)過固定相時(shí)，各組分隨流動(dòng)相移動(dòng)速度不同，從而達(dá)到分離各組分的目的。吸附層析：利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，而使混合物中的各組分分離的方法。離子交換層析：依據(jù)被分離物質(zhì)與分離介質(zhì)間異種電荷的靜電引力的不同來進(jìn)行物質(zhì)分離的。凝膠過濾層析：也稱分子篩層析、凝膠過濾、排阻層析。是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。親和層析：利用生物分子對之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化的技術(shù)。7/3/20233（一）吸附層析法1、概念吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，而使混合物中的各組分分離的方法。圖2、吸附劑硅藻土、氧化鋁、磷酸鈣、羥基磷灰石和活性炭等。例一般在低pH值、低離子強(qiáng)度的條件下對酶進(jìn)行吸附，而在提高pH值和增加離子強(qiáng)度的條件下，酶可解吸洗脫出來。3、吸附層析方法①吸附劑可裝在吸附柱上進(jìn)行吸附柱層析；②把吸附劑加到酶液中，吸附后過濾出來，再加洗脫劑，使酶解吸而洗脫出來。4、特點(diǎn)與應(yīng)用設(shè)備簡單，操作容易，吸附劑來源豐富，價(jià)格低廉，又具有的一定的分辨率，是層析中應(yīng)用最早，而且至今仍廣泛應(yīng)用的層析分離技術(shù)。

枯草桿菌α-淀粉酶在弱酸性條件下，可吸附在氧化鋁上，再用pH8～9的Na3PO3溶液洗脫；中性蛋白酶可在pH6.5～8.5條件下，用硅藻土吸附，再在pH9～11.5的2%氯化鈉溶液中洗脫出來。7/3/20234吸附層析法圖7/3/20235（二）離子交換層析1、原理：依據(jù)被分離物質(zhì)與分離介質(zhì)間異種電荷的靜電引力的不同來進(jìn)行物質(zhì)分離。

2、離子交換劑的構(gòu)成：基質(zhì)、功能基團(tuán)（電荷基團(tuán)）、反離子。羧甲基纖維素（CM-纖維素）：纖維素-O-CH2-COO-Na反離子基質(zhì)電荷基團(tuán)3、離子交換劑的種類4、離子交換劑的選擇5、離子交換層析的操作流程6、離子交換層析的應(yīng)用：制備純化生命物質(zhì)：活性可保存、分辨率高、測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。7/3/20236離子交換原理圖7/3/202373、離子交換劑的種類基質(zhì)電荷基團(tuán)疏水性：人工合成的與水結(jié)合力較小的樹脂類物質(zhì)，分離小分子物質(zhì)。大孔樹脂可用于酶。（離子交換樹脂）親水性：天然或人工合成的與水結(jié)合力較大的物質(zhì)。（離子交換纖維素、離子交換凝膠）陽離子交換劑：電荷基團(tuán)為（-），反離子為（+），與溶液中的陽離子交換，分為強(qiáng)型和弱型陰離子交換劑：電荷基團(tuán)為（+），反離子為（-），與溶液中的陰離子交換，也分為強(qiáng)型和弱型常用的離子交換介（基）質(zhì)

離子交換劑保存劑7/3/20238親水性離子交換劑離子交換纖維素是以纖維素為母體引入活性基團(tuán)而制成，親水性能好，活性基團(tuán)分布在纖維素表面，交換容量較大，是目前在酶的分離純化方面廣泛應(yīng)用的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、AE-纖維素、CMC（羧甲基纖維素）等。離子交換凝膠是以葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等為母體引入若干活性基團(tuán)制成。這種離子交換劑同時(shí)具有離子交換和分子篩的作用，交換容量大，分辨能力強(qiáng)，在酶的分離純化方面具有廣闊的應(yīng)用前景。常用的有DEAE葡聚糖凝膠、DEAE聚丙烯酰胺凝膠、DEAE瓊脂糖凝膠、CM凝膠、SE（磺酸乙基）葡聚糖凝膠、SP（磺酸丙基）葡聚糖凝膠等。

7/3/20239常用誕離子鳴交換篇介質(zhì)6/巴27買/2猜02打310離子字交換眉劑保納存劑6/略27般/2鼓02奏3114、離赤子交案換劑把的選壤擇強(qiáng)弱歷離子好交換董劑的會(huì)選擇：強(qiáng)型盤：適鍵用范灰圍廣曲，無咽離子蜜水中衫或極服端pH條件腫下穩(wěn)灶定。弱型挽：適膛用范補(bǔ)圍窄棋，適拍合分漁離生遷物大推分子僵物質(zhì)燦。酶蛋咽白的pI為6-幫9時(shí)，筍考慮刪用強(qiáng)慰型離練子交矩?fù)Q劑扁?；|(zhì)撕的選桐擇：分離孟有活蜘性的罩生物催大分婦子物玩質(zhì)時(shí)部，親駁水性堂好于火疏水外性。離子菌交換勁劑類昌型的槍選擇：考慮透酶的告穩(wěn)定哭性酶在pH＜pI的條暫件下嶺穩(wěn)定仁，酶梁帶正掠電，波用陽棟離子綢交換錯(cuò)劑；酶在pH＞pI的條燈件下貝穩(wěn)定幸，酶方帶負(fù)徐電，許用陰結(jié)離子許交換你劑；在兩前種條婆件下征都穩(wěn)孔定時(shí)褲，二屑種交俱換劑項(xiàng)都可撓應(yīng)用羊。6/飾27憑/2迫02伐3125、離疤子交昌換層博析操顏?zhàn)髁鏖L程①離廁子交缸換劑減可裝忽成離殃子交溪換柱針進(jìn)行柱層析駛；②可川將離惑子交艘換劑妙加到正酶液棕中，催待交轉(zhuǎn)換后摔，將角離子圈交換砌劑過劈燕濾分言離出含來，接再用鬼洗脫既劑將位酶洗色脫出越來。離子皺交換森柱層逐析主凍要操雙作過諒程：（1）離薯子交鹿換劑辮的處監(jiān)理與申裝柱（2）上新柱（3）洗眨脫和例收集（4）離貌子交夜換劑枯的再鹽生6/役27套/2盜02蹄313（1）離悠子交柴換劑饞的處號理與醒裝柱①預(yù)羅處理羽：浸屯泡與誤脫氣將干陶燥的宮離子騰交換嘗劑用棒水浸偉泡2h以上域，充究分吸敞水膨諸脹后呢，減伙壓抽襖除氣允泡，晝傾去蹈水，煉用無月離子似水洗沿至澄雕清。嫩再先荷后用4倍體洗積左單右的2m嗽ol輔/L鹽酸循和2m欣ol希/L氫氧刷化鈉賊浸泡訴各4h，再用攔無離徒子水臭洗至精中性裳。②轉(zhuǎn)哲型經(jīng)上竟述處漲理后毅的離踢子交鳥換劑澡需經(jīng)陶轉(zhuǎn)型騾，使躺離子化交換知?jiǎng)┧菐У幕鹂山浑y換離究子轉(zhuǎn)狂變?yōu)樾圻m當(dāng)孟的離注子型征。如性陽離幣子交光換劑酷用Na辣O(jiān)H處理硬，轉(zhuǎn)隆為Na+型；斥用HC諸l處理唱，轉(zhuǎn)冶為H+型。述陰離謝子交糧換劑齒用Na芝OH處理轎成OH-型；鮮用HC罪l處理兄成Cl-型等房誠。交額換劑桃在使芝用后復(fù)也需貪經(jīng)轉(zhuǎn)齊型，沃使之震得以立再生平以重酷復(fù)使杯用。③裝累柱轉(zhuǎn)型炭后的勻離子羨交換決劑小循心地薦裝進(jìn)纖交換下柱?？逞b柱駐的好租壞對甜分離動(dòng)效果擠有影貸響，逮要求蛛裝填英得均勻東，無皆氣泡悲，無外裂紋。裝伙好后甲，保濫持液標(biāo)面在草交換域劑平狠面以晌上，倉防止將空氣殼進(jìn)入異。6/成27鼓/2扣02越314（2）上波柱①樣萍品液急的控蒜制：上丹柱時(shí)兇要注扭意酶詳液的pH值、跌溫度跨和離嚇子強(qiáng)守度等條古件。②上悔柱：打暫開離忙子交逢換柱華出口孔閥，咬讓柱蒙內(nèi)液銀體慢民慢流閘出。送當(dāng)液夏面剛蜂好到粗達(dá)交街換劑豈表面茫時(shí)，執(zhí)小心符加進(jìn)碑酶液御，使邁酶液夏盡快均勻地分柴布于舉交換妄劑全墨表面鞏，然茄后均織勻進(jìn)危入交巧換劑憂層進(jìn)塘行離鉛子交晚換。踩繼續(xù)帶加入扁酶液啞，直定至交繭換劑疲的交餡換容孤量飽和為止需。③流矩速的留控制：要催控制便好流速。流咸速太樂快，捆分離即效果膜不好質(zhì)；流挑速太輛慢，悶則影銳響分任離速錯(cuò)度。漲有時(shí)勺由于講離子份交換忠劑顆努粒太贏細(xì)，屋或柱越較高限，或登酶液鑰濃度公、粘隔度較傍高等善原因絲式引起撇流速犧太慢拆時(shí)，升為加快慌離子荒交換西層析爹速度，可勞采用求在柱漫進(jìn)口死適當(dāng)加壓或在普出口歷適當(dāng)減壓的方泄法。6/供27元/2拾02躲315（3）洗冊脫和筒收集①洗學(xué)未吸稱附物上柱慎完畢暑后，繪先用姥水或壤緩沖婆液流品過層騰析柱球，使團(tuán)未吸演附的著物質(zhì)鐮洗出討。②洗轟脫目廊標(biāo)物用適旦當(dāng)?shù)奶疵撘艘海魧⑽谈皆谶~離子鑒交換中劑上勒的離緣瑞子按親勞和力敵自小仍至大值的順鍛序逐憐次洗亡脫下來化，分別域收集，以盜達(dá)到奴分離逆目的善。若酶鳳液組關(guān)分很蜘復(fù)雜霧，用峰一種構(gòu)洗脫沸液還使達(dá)不押到良樸好的湊分離采效果懂。為必此，膠可采太用連葉續(xù)或志階梯晶式的梯度準(zhǔn)洗脫懸法。即歷采用貫按一示定規(guī)橋律改牢變pH值（pH值梯咱度）炸或鹽拜濃度澡（濃童度梯野度）舌的洗旁脫液琴進(jìn)行豈洗脫狐。連續(xù)躺梯度抓洗脫內(nèi)液可按公預(yù)先渾設(shè)計(jì)鴨的梯勵(lì)度范毯圍，串在梯為度混氧合器育中配進(jìn)置。鍬而階梯盜式梯狂度洗訂脫液則分任別配截置幾稈種不慮同pH值或攔不同波鹽濃短度的電緩沖憤液，拔使用或時(shí)按態(tài)設(shè)計(jì)征好次勉序依逝次洗誤脫。6/繞27膀/2慣02陪316（4）離緒子交眼換劑島的再命生洗脫憲收集榴完畢娃后，洪為使秋離子縱交換華劑再答次使倚用，浸需要含經(jīng)過慰再生勿處理叫。①含雜質(zhì)車較少時(shí)，望再生罪只要棟用酸油、堿腦或鹽突進(jìn)行轉(zhuǎn)型即可犧；②含雜質(zhì)撇較多的情憐況下領(lǐng)，再而生時(shí)免要先科經(jīng)過酸、嬌堿浸按泡清洗蔥，用事水洗族至中哀性，焦然后再轉(zhuǎn)蹄型，以膛備再征次上瘦柱進(jìn)快行交搬換。堵如此憑循環(huán)軌往復(fù)倘，離鋪?zhàn)咏粵r換劑妻可反怎復(fù)使竹用一濤段較市長的乎時(shí)間濤。如離勉子交刪換柱只要較拉長時(shí)航間停允用，龍可在濾再生開后，訊加入由適當(dāng)下的防腐插劑以防暗止微愉生物帶生長獲。陽剩離子凳交換率樹脂僻常用0.陸02貝%的疊留氮鈉作為放防腐出劑。鋼而陰強(qiáng)離子胡交換卸樹脂饅常用脾的防躬腐劑染是10顆pp頁m的苯桃乙酸薄汞等。6/遠(yuǎn)27借/2電02勢317（三他）凝原膠過腸濾層訓(xùn)析1、原進(jìn)理：依據(jù)裝分子笛篩效調(diào)應(yīng)，玩按分升子的大小定和形逃狀來分膝離樣套品。當(dāng)樣王品經(jīng)去過分撞子篩耳介質(zhì)底時(shí)，項(xiàng)由于襯分子捎篩有斯一定傍大小故和孔皆徑，屠小分折子樣方品進(jìn)短入顆黃粒內(nèi)團(tuán)部，筒大分喝子由初于進(jìn)股不了貴顆粒娛內(nèi)部陣而直轉(zhuǎn)接流挖出來趨，它屠與進(jìn)顆入顆寄粒的路小分場子相冒比，這流過粒柱的薦路程宏相對民較短低。2、分鄰配系須數(shù)（Kd）：反映泛凝膠蟲對溶臉質(zhì)排授阻程思度的量。Kd值的證意義Kd值的板計(jì)算3、凝膠青種類：葡聚傻糖凝橋膠、瓊脂愚糖凝回膠、聚丙碗烯酰立胺凝領(lǐng)膠常用本凝膠應(yīng)過濾逼層析擱介質(zhì)4、影炎響凝叔膠過暈濾的姜因素墓：5、凝儲(chǔ)膠過云濾層槳析的揀應(yīng)用榜：Ve-VoViKd=6/赤27穿/2串02扭3181、凝飼膠過林濾層鐵析的餡原理6/叢27紀(jì)/2船02怠3192、分愛配系化數(shù)為了紛定量荒地衡非量各慮組分腰的流朱出順滾序，惰常常態(tài)采用捧分配須系數(shù)Kd來量歪度。Kd值是反映權(quán)凝膠質(zhì)對溶暗質(zhì)排笛阻程西度的喊量。Ve：某組防分的告洗脫強(qiáng)體積緊，該丟組分液從加久進(jìn)層饅析柱足到流組出液遣中該是組分星出現(xiàn)厚高峰概時(shí)所獻(xiàn)用洗擔(dān)脫液鼻體積（mL）Vo：外（瞞水）掙體積幸，層安析柱巾內(nèi)凝那膠之盟間空統(tǒng)隙的器體積（mL）Vi：內(nèi)（到水）文體積借，層迎析柱慚內(nèi)凝機(jī)膠顆氏粒內(nèi)費(fèi)部微婦孔的謀體積(mL)6/弟27如/2病02質(zhì)320（1）Kd值的敬意義Kd=0時(shí)即Ve=Vo，該組暴分足膜夠大勢，不直能進(jìn)雖入微喜孔，莊最先豆流出誦。Kd=1時(shí)即Ve=Vo+Vi，該組其分可哥進(jìn)入供全部掃的微著孔，梢最后鍛流出幕。0<Kd<1Kd小的向先流巧出，Kd大的丘后流優(yōu)出。Kd可定量地衡貧量各哪組分畢的流從出順效序，曠也是旨判斷郵分離障效果欠的參確數(shù)。盤當(dāng)Kd差異跨大時(shí)跳，分壓離效絨果好扎，險(xiǎn)差異因小時(shí)例，分糧離效杯果差石。Ve-VoViKd=6/宗27個(gè)/2唐02肅321（2）Kd值的喪計(jì)算Ve、Vo和Vi與凝顯膠種截類、駛凝膠先型號桂、凝扮膠處春理方風(fēng)法、視裝柱播量的嬌多少近以及兵裝柱纏質(zhì)量殿等因菊素都左有密潛切關(guān)界系。尖對于般不同班的凝戲膠柱謠，其置數(shù)值銜都往傲往不份同。皺所以種，需端要在附裝好棄凝膠謀柱后神，在乘使用互于酶微液分注離之躲前，腿通過周試驗(yàn)竊，測定拼該層倚析柱既的Vo和Vi（圖例噴），并對躬某些彎已知酬組分的Ve進(jìn)行薪測定勾，從脫而計(jì)尺算出佩其Kd值。在凝戚膠柱稅裝好追后，脅要盡臟量維汽持相貼同的單使用移條件遷，使瀉各組朵分的Kd值保草持一崇定，撿即保磚持各要組分精的流嘆出順錯(cuò)序，裹從而逼達(dá)到手良好總的分亮離效撓果。6/早27覺/2怨02霉322Vo和Vi的測肺定當(dāng)把闊分子崇量不艱同的棗混合方溶液針鋪在總凝膠鄉(xiāng)豐床上樂時(shí)，營其在黃內(nèi)水腦體積預(yù)和外源水體沸積中備的分吹布是劍不一熱樣的仰。Vo：溶液己中的督分子托大于固凝膠挨孔徑卷上限傅者不浴能進(jìn)廚入凝繼膠網(wǎng)血孔內(nèi)反，如藍(lán)色騰葡聚糖都（bl脹uede邪xt巧ra述n，分子魄量約2便00忍000級0），而被功排阻據(jù)在外己水體縣積的竄溶液途中?；z烈床的窩洗脫諷體積Ve剛好木等于別外水榴體積洪。即Ve=V缸o(hù)僻(Kd=0擾)。Vi：溶液事中的揀分子速小于棗凝膠研孔徑估下限絹者,（如T2O，tr拋it喇iu炊m拼ox咽id尺e，氧化蛇氚，嫁氚水?dāng)y）能鞋自由滑進(jìn)入倉凝膠貫網(wǎng)孔申內(nèi)，劃凝膠渣床的殘洗脫蟻體積Ve應(yīng)等仗于凝復(fù)膠床辱總體潔積，抖即Ve=Vt=渾Vo肅+V拒i涼(Kd=1釣)。也可從凝大膠干、面濕重超差求得油。而溶蠟液中稍的分賣子大襖小介揚(yáng)于凝士膠孔桶徑上燙限和蛛下限淺之間虎者，質(zhì)則能踢進(jìn)入糠部分家凝膠丹網(wǎng)孔倦中，聚故其喬洗脫強(qiáng)體積Ve是在Vo和Vt之間躬（Kd在0～1之間塞）。6/千27適/2灶02商323（1）葡救聚糖采凝膠構(gòu)成蛙：以葡掙聚糖濕（葡貓?zhí)烟羌彝ㄟ^1，6糖苷趨鍵結(jié)兆合而教成的戀線性判高分征子）先為單想體，浙以1，2-環(huán)氧異氯丙本烷為練交聯(lián)歡劑聚營合而成膽。Se緒ph搏ad徒ex：G值后索的數(shù)然值為成該類禁型凝食膠膨娘潤時(shí)瞧吸水悅量的10倍。干如：G-湯25表示1g凝膠加可吸堪收2.憲5m娛l水。G值小據(jù)，吸粥水量械少，楊凝膠孔孔徑疲小，殃適合均于較晶小分室子的竟分離頂；G值大菊，吸連水量遇多，賴凝膠陜孔徑達(dá)大，損適合李于較婆大分逗子的樓分離掌。特點(diǎn)勤：有良配好的驚化學(xué)候穩(wěn)定姐性（斧耐酸懇堿）他和熱保穩(wěn)定榴性，浙室溫弦保存原要防達(dá)腐。葡聚短糖凝包膠系民酸性州物質(zhì)越，能麥與堿斑性蛋汽白發(fā)醫(yī)生吸袍附作況用。料當(dāng)離子渴強(qiáng)度參大于0.景05時(shí)吸附距作用顫可喪版失。葡聚龜糖凝糧膠的動(dòng)操作儀流程6/仍27齒/2機(jī)02貫324葡聚拼糖凝獲膠的暈操作栽流程選擇剖凝膠陜和溶脹：可根據(jù)抱分子聾量大竭小范充圍選俯擇凝肚膠，籃還有導(dǎo)粗中港細(xì)之洗分，孟粗分克用中蜓粗的挖凝膠搭，分敲析工質(zhì)作用結(jié)細(xì)的挨凝膠型。水四浸過閑夜或昌沸水耽煮2h撕r（速度佳快且湯可以歪殺菌僑）。裝柱：均勻宰、無綢紋路舌、無氣泡癢（蘭稈色葡聚疲糖20維00檢驗(yàn)談），用勞緩沖倆液平赴衡。上樣芝和洗脫潛：體積不超潑過柱苗床體陽積的1/博4毯0。然飛后用撲緩沖逆液洗澤脫，醬注意仁流速止和操叫作壓愿。再生：稀鹽棵和緩蝕沖液失洗滌楊，保藏存在之液體毒中，鳳為防菠止微迎生物記生長隔，抬加0.目02蝴%雀Na吊N3（使用靜時(shí)可麻能會(huì)思抑制傍所要陡分離位的酶償）。6/帶27罷/2決02勒325（2）瓊侍脂糖捉凝膠構(gòu)成譽(yù)：由D-半乳訪糖和3,屠6-脫水棄半乳姥糖連嚷接構(gòu)額成的哈糖鏈之。本誓身不差包含辯另外渣的交園聯(lián)物帽質(zhì)，宋依靠謎糖基批之間呼的氫盼鍵作霉用形伙成穩(wěn)離定的唐網(wǎng)狀夠結(jié)構(gòu)舅。Se勾ph借ar遠(yuǎn)os趴e：數(shù)字算表示丙瓊脂壁糖含窯量（2B表示汽含量令為2%），君數(shù)字豬越大公含量冬越高漆，但粉篩孔皂越小疲。特點(diǎn)終：孔徑方較大紙，非視特異康吸附肝作用冊小，早但穩(wěn)躬定性株差。Se膽ph狡ar亡os汪e-C屆L型乓：是瓊譯脂糖境在強(qiáng)示堿性朝條件冒下與1,跨3-二溴俗異丙陰醇生何成的交聯(lián)溜型瓊漿脂糖?？咨褟脚c古同濃基度未冬交聯(lián)典瓊脂販糖相軌同，踏但熱頂穩(wěn)定叢性和膜化學(xué)執(zhí)穩(wěn)定鞋性都吼有提學(xué)高，賴可在0-價(jià)40℃、pH那3-辱14間使牌用。6/冒27燒/2筒02鼓326（3）聚攪丙烯腸酰胺業(yè)凝膠構(gòu)成捉：人工桌合成撓凝膠辮。是稼以丙伴烯酰慣胺為個(gè)單體庸，以救甲叉燃雙丙脈烯酰屆胺為急交聯(lián)口劑聚低合成家的高沿分子洋聚合韻物，件通過爹改變座單體炕和交齒聯(lián)劑攀濃度豬可改憤變凝卸膠孔陸徑。Bi須o-小ge責(zé)l遷P系列奪：P值越或大孔科徑也皂越大索，數(shù)倡值*10奮00表示倡排阻太限度粉，可栽根據(jù)川欲分兼離的談分子亮量選抗擇適雅宜的池凝膠券。特點(diǎn)斑：屬于秋惰性域凝膠尤，但論遇強(qiáng)理酸時(shí)神，可賣能使敗其中塌的酰苦胺鍵雁水解夕而遭推到破之壞。6/循27叼/2丈02蘆327廠家/商品名型號凝膠種類備注Bio-RedBio-gelPBio-gelAP-2、P-4、P-5P-10、P-30、P-60、P-100、P-150、P-200、P-300聚丙烯酰胺不同型號所排阻的蛋白質(zhì)分子量不同A-0.5m、A-1.5m、A-5.0m、A-15m、A-50m、A-150m瓊脂糖LKBUltrogelAgaroseACA22、ACA34、ACA44、ACA54、瓊脂糖/聚丙烯酰胺A2、A4、A6瓊脂糖PharmaciaSephadexSepharoseSephecrylG-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、G-200葡聚糖6B、4B、2B瓊脂糖CL-3B、CL-4B、CL-2B交聯(lián)瓊脂糖S-200、S-300、S-400、S-500、S-1000葡聚糖/雙丙烯酰胺常用戴凝膠掩過濾達(dá)層析叼介質(zhì)6/殲27存/2閘02駐3284、影捆響凝征膠過罵濾層梯析的棉因素選擇暴合適紐奉的凝膠鳥粒度：細(xì)探顆粒聞凝膠茫分辨局率高盟，但鏟洗脫趴慢；柱長：L/棉D(zhuǎn)高的游柱子閣分辨權(quán)率高繡，但摘影響預(yù)流速絲式；層析死柱的名裝柱骨質(zhì)量匪：減昏少氣糖泡和軟裂紋千；樣品嶺體積：量憶少，從分辨覆率清敘晰，參用于司分析脫目的扮時(shí)不雁超過柱床體欠積的5%，脫愉鹽時(shí)10訊%左右齒。制饞備層?jì)屛隹?5田%-作30魂%；洗脫鋪液的流速：流攔速快某分辨寄率低耍。6/盛27刊/2傅02悼3295、凝旬膠過江濾層紅析的腥應(yīng)用生物冬大分扔子的禽脫鹽克和濃傅縮；分離秋生命得物質(zhì)黨（對垃某些夫理化叛性質(zhì)梢相似裹如溶爸解度大、帶惕電性灣質(zhì)等患，但便分子瓣量不紡?fù)暮够旌先挂海┩?；去除蕩熱源樣物質(zhì)綿；分子族量檢伶測；其它云：DE它AE細(xì)-Se蘋ph猜ad飽ex可作館為離鴉子交橫換層詳析介盟質(zhì)。6/壟27劫/2赴02計(jì)330（四騙）親士和層孫析1、原石理：利用酬生物纖大分蒙子與烘配基甲之間煎所具熱有的專一剝又可豆逆的結(jié)沾合，四將配足基共殖價(jià)連岡接在賭固相祝載體坐（基屢質(zhì)）壺上，迫通過松層析家柱的驗(yàn)生物輩大分棉子就腫能以鼓其高雕親和見力與堡配基不特異慈結(jié)合塞，與制其它料雜質(zhì)針分離墾而達(dá)耀到純機(jī)化目較的。親和東層析望是從染復(fù)雜率混合就物中準(zhǔn)純化梳蛋白專質(zhì)的撿最好敬的方底法。2、親贈(zèng)和層夢析基漆質(zhì)和索配體擁：3、基警質(zhì)與誦配體柿偶聯(lián)絕：4、親梅和層遙析操梁作步眨驟：5、親膛和層循析的應(yīng)用返：（6/照27弊/2轟02長3311、親群和層茶析的單原理6/蝴27激/2萄02騾3322、親倆和層潤析基蛙質(zhì)和別配體理想仇的基質(zhì)應(yīng)滿廉足的獅條件將：（1）能榆構(gòu)成采松散竿的多宴孔網(wǎng)守絡(luò)；（2）努極低次的非暈特異廊性吸林附；（3）簽高度揉的親漂水性枝；（4）循較好偶的理煤化穩(wěn)封定性陽；（5）具食有大拉量能盈活化先并與形配基礙結(jié)合龜?shù)幕綀F(tuán)?？晒Q選擇昆的親賺和層語析基采質(zhì)：瓊脂里糖、憑葡聚須糖、才聚丙刻烯酰綁胺、僑纖維么素等。以4%的交偽聯(lián)瓊旬脂糖丈（Se紗ph差ar緣瑞os釋e4B）最為難常見。親和用層析配體的條件抬：（1）與垃純化槐的物鹽質(zhì)有或較強(qiáng)競的親索和力慣；（2）具糟有與?；|(zhì)醒共價(jià)盤結(jié)合噴的基丹團(tuán)。瞎如：蟲底物洪、底區(qū)物類丈似物紡、別飲構(gòu)酶皇的效遙應(yīng)因偶子、評輔因拔子、畜抑制并劑、統(tǒng)抗體庸、染蠶料等睜。6/肝27代/2鑰02掠333親和沖層析洋的幾挺個(gè)名懶詞在成盞對互睛配的請生物吧分子酸中，收可把粥任何微一方紗作為固定心相，而推對樣優(yōu)品溶輛液（孔流動(dòng)頂相）左中的辭另一精方分禿子進(jìn)或行親頓和層叢析。卵例如凝，酶天與其愚輔酶倦是分望子對辱，既幟可把僚輔酶羽作為木固定紙相，晶對樣遵品液膏中的鉆酶進(jìn)梯行親任和層齡析分汪離；鮮也可障把酶腰作為暮固定宏相，扇使樣罪品液啞中的針輔酶默分離貿(mào)純化悅。在上親和慮層析招中，墨作為內(nèi)固定球相的至一方樣稱為配體疤（配輝基）。配基蘋必須朝偶聯(lián)灰于不搶溶性島母體負(fù)上。母體又稱載體或擔(dān)體或基質(zhì)，一綱般采霧用瓊擾脂糖狡凝膠鈴、葡樓聚糖睜凝膠敲、聚華丙烯截酰胺休凝膠海和纖嘉維素午等作脈為母巡壽體。活化索后的幫不溶統(tǒng)性母塵體已版有商帆品出不售，輝商品岡名為偶聯(lián)謎凝膠。6/僵27羊/2話02功3343、基敢質(zhì)和近配體譯的偶測聯(lián)基質(zhì)決的活碧化：CN亂Br法：作用瞞于葡睛聚糖敏或瓊付脂糖靈的羥究基上界，形距成活逗潑的確亞氨嘴基碳氧酸鹽疑衍生蓮物。引入皂連接逃（手散）臂語：通過嫩直接目偶聯(lián)雹的方榜式得脂到的末親和疼吸附搭劑，嫂基質(zhì)顯和配?；g拍距離勻較近撐，形穩(wěn)成空醫(yī)間位前阻，糊難于才進(jìn)行公親和構(gòu)作用斜。通答常在鑒基質(zhì)總與配龍?bào)w間丙引入街適當(dāng)誤長度蜻的連逼接臂袍。使模配基遷能自反由伸善入溶轎液而冬增進(jìn)戀對酶拴分子劃的吸散附效農(nóng)率。殼常用皇的連扶接臂塘為二緩胺化尋合物竭。圖例偶聯(lián)雨：一般障在活士化后申快速剃進(jìn)行兇。OHOHCN頑BrOOC=純NHpH侮116/含27嘴/2傳02蜘335親和懶層析上連接齡臂的帳作用6/黨27攜/2飄02澡3