分子生物學(xué)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-課件

第三章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（polymerasechainreaction,PCR）1ppt課件聚合酶鏈反應(yīng)又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過(guò)變性-退火-延伸循環(huán)操作，在體外特異地?cái)U(kuò)增所需要的DNA片段的一種技術(shù)。它能快速將皮克(pg)水平的DNA特異地?cái)U(kuò)增100萬(wàn)倍左右，達(dá)到微克(g)水平。優(yōu)點(diǎn)：敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡(jiǎn)便等。2ppt課件在分子生物學(xué)、基因工程研究，以及遺傳病、傳染病和惡性腫瘤等基因診斷和研究中得到廣泛應(yīng)用。并已普及到許多普通實(shí)驗(yàn)室，大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，便于對(duì)目的基因進(jìn)行分析、鑒定。3ppt課件目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子4ppt課件

通常的DNA擴(kuò)增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導(dǎo)入細(xì)胞后進(jìn)行擴(kuò)增,還要用同位索探針進(jìn)行篩選;要經(jīng)過(guò)DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過(guò)程，操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時(shí)間。5ppt課件70年代的初期由Dr.H.Klenow發(fā)現(xiàn)了較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的KlenowfragmentofE.Coli；1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermusaquaticus）分離出來(lái)的Taqpolymerase，它的特性能耐高溫。80年代之后它被廣泛運(yùn)用；1983年美國(guó)Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)方法；1985年美國(guó)PE-Cetus公司開(kāi)發(fā)出了具有應(yīng)用價(jià)值的PCR技術(shù)；1987年引入了耐高溫的DNA聚合酶，從而使PCR成為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，而迅速在世界各地推廣。1993年Mullis也因此獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)6ppt課件KaryBMullis

(1944-)

1983年提出PCR方法

1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)7ppt課件

一、PCR基本原理PCR是一項(xiàng)DNA體外合成技術(shù)，類(lèi)似于生物體內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程。依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理。PCR合成DNA比細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)單。第一節(jié)PCR技術(shù)的原理和特點(diǎn)8ppt課件細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過(guò)程1）細(xì)胞內(nèi)有關(guān)蛋白質(zhì)參與下，DNA雙螺旋解鏈成兩條單鏈，各自作為模板。2）引物酶以兩條單鏈為模板各自合成一段引物，引物提供3’-OH末端。3）DNA聚合酶以親代DNA單鏈為模板，以dNTP為原料，按照堿基配對(duì)的原則，從引物的3’端，循5’→3’方向，將脫氧核苷酸聚合，最終形成子代的DNA雙鏈。9ppt課件Denaturing95?CAnnealingTm-5?CExtension72?CPCR的原理10ppt課件PCR的基本過(guò)程1.變性：將反應(yīng)體系升溫至95℃左右，樣品中雙鏈DNA解開(kāi)成兩條單鏈，各自作為模板（待拷貝的DNA稱為模板）

。2.退火：將溫度降至引物的Tm值以下(55℃左右)，5’端和3’端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合。5’5’3’3’編碼鏈3’端引物5’端引物3’3’11ppt課件3.延伸：將溫度升到75℃左右，耐熱的TaqDNA聚合酶催化四種

dNTP，從引物3’-OH端開(kāi)始，依據(jù)模板堿基序列互補(bǔ)方式依次聚合，合成一條互補(bǔ)的DNA鏈。5’5’3’3’5’DNA聚合酶5’12ppt課件Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。13ppt課件瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物的鑒定、提取14ppt課件PCR的擴(kuò)增效應(yīng)理論上，每增加1個(gè)循環(huán)，雙鏈DNA片段會(huì)增加1倍，使DNA量可成指數(shù)(2n)增加。實(shí)際上，擴(kuò)增效應(yīng)低于指數(shù)增加，約為(1+X)n。一般進(jìn)行30個(gè)左右的循環(huán)，特定區(qū)域的DNA量可至少增加106

倍。15ppt課件PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律PCR反應(yīng)初期，目的DNA片段的增加呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的逐漸積累，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的增幅減慢，即出現(xiàn)“平臺(tái)效應(yīng)”。到達(dá)平臺(tái)期所需要的循環(huán)次數(shù)一般在30次循環(huán)之后。16ppt課件

PCR

DNA復(fù)制部位：

DNA體外合成放大過(guò)程生物體內(nèi)DNA合成引物：

DNA引物RNA引物（作為新鏈的一部分）（復(fù)制終止時(shí)被切除）催化酶：TaqDNA聚合酶DNA聚合酶有5’→3’核酸外切酶有5’→3’核酸外切酶無(wú)3’→5’核酸外切酶有3’→5’核酸外切酶基本過(guò)程：每循環(huán)一次包括復(fù)制起始、鏈延伸和變性、退火、延伸終止三階段反應(yīng)實(shí)質(zhì)：擴(kuò)增靶DNA合成子代DNA17ppt課件PCR儀

聚合酶鏈反應(yīng)中的變性、退火、延伸的溫度和時(shí)間，以及循環(huán)次數(shù)，是由具有程控的快速升溫和快速降溫裝置的PCR儀控制。18ppt課件19ppt課件20ppt課件PCR儀越快，越精確，越昂貴21ppt課件ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀22ppt課件23ppt課件二、PCR技術(shù)的特點(diǎn)1.高度的敏感性：可將極微量(pg)DNA，擴(kuò)增到紫外光可見(jiàn)的水平(ug)，這是最主要的特點(diǎn)，它可對(duì)單拷貝基因、單個(gè)細(xì)胞、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進(jìn)行分析。24ppt課件2.高度的特異性：PCR擴(kuò)增的特異性由兩個(gè)引物的序列決定，因此引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要。①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②遵循堿基配對(duì)原則；

③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。25ppt課件引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。基因組26ppt課件3.適用樣品的廣泛性：

對(duì)樣品的要求并不十分嚴(yán)格：

1)可以是DNA，也可以是RNA

2)可以是純化的，也可以是粗制的

3)可以是新鮮組織，也可以是陳舊組織

4)可以是細(xì)胞，也可以是體液4.

操作簡(jiǎn)便、快速：PCR自動(dòng)化，數(shù)小時(shí)完成。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。

27ppt課件三、參與PCR反應(yīng)體系

的因素及其作用模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2+緩沖液反應(yīng)溫度循環(huán)次數(shù)PCR儀等

PCR體系28ppt課件（一）模板—核酸

1.模板：指能擴(kuò)增靶DNA片段的核酸2.DNA是直接模板，RNA是間接模板

RNA樣品必須先經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板。這個(gè)技術(shù)稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。29ppt課件病原體標(biāo)本：有病毒、細(xì)菌、真菌、螺旋體、立克次體、支原體等。病理生理標(biāo)本：有細(xì)胞、血液、絨毛、羊水細(xì)胞、尿液、上皮細(xì)胞、體外培養(yǎng)細(xì)胞系。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本：有血斑、精斑、毛發(fā)等?？脊艠?biāo)本：殘留有核酸物質(zhì)3.常見(jiàn)的擴(kuò)增對(duì)象(含核酸的標(biāo)本)：30ppt課件4.避免有影響擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)存在如：核酸酶：降解DNA、RAN

蛋白酶：降解TaqDNA聚合酶血紅素、抗凝劑：抑制TaqDNA聚合酶活性理論上，要獲得最好的特異性及忠實(shí)性的擴(kuò)增只向反應(yīng)體系中加入單一拷貝的靶序列DNA作為模板。

31ppt課件人基因組DNA0.1-1μg大腸桿菌基因組DNA10-100ngλDNA0.5-5ng質(zhì)粒DNA0.1-10ng5.模板量要合適，一般為102~105拷貝。50μlPCR反應(yīng)體系中模板DNA推薦使用量32ppt課件（二）引物1）引物：2條人工合成的、能與模板DNA互補(bǔ)結(jié)合的脫氧寡核苷酸。1.引物的性質(zhì)和作用33ppt課件2）引物的序列：根據(jù)欲擴(kuò)增的DNA片段兩端序列而設(shè)計(jì)的。5’端引物：與模板鏈的5’端序列相同；3’端引物：與模板鏈的3’端序列互補(bǔ)。5’5’3’3’模板鏈3’端引物5’端引物3’3’34ppt課件3)

引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和

長(zhǎng)度。4)引物設(shè)計(jì)決定PCR反應(yīng)的成敗。特異性：引物只針對(duì)DNA的一個(gè)特定序列互補(bǔ)結(jié)合，因此2條引物與DNA模板特異性結(jié)合決定了要擴(kuò)增的DNA區(qū)域。長(zhǎng)度：2條引物分別互補(bǔ)于所要擴(kuò)增DNA片段的兩端，使DNA片段的擴(kuò)增只限于引物之間的部位。35ppt課件2.引物設(shè)計(jì)的基本要求1）引物長(zhǎng)度要合適，一般為16～30個(gè)核苷酸，常用20bp左右。引物過(guò)短：會(huì)影響PCR的特異性；引物過(guò)長(zhǎng)：需提高相應(yīng)的退火溫度，若超過(guò)延伸溫度即TaqDNA酶的最適溫度，則影響PCR反應(yīng)產(chǎn)物。36ppt課件2）G+C含量一般占50％～60％，有利于引物與模板的結(jié)合。GC太少擴(kuò)增效果不佳，GC過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。3）ATCG4種堿基隨機(jī)分布，避免連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好隨機(jī)分布。否則易使引物與模板的嘌呤或嘧啶密集區(qū)發(fā)生錯(cuò)配。4）引物內(nèi)部不能存在互補(bǔ)序列，以避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。5）兩個(gè)引物之間不能存在互補(bǔ)序列，以避免形成引物二聚體。37ppt課件6）引物與非特異性序列的同源性不能超過(guò)70%或不能有連續(xù)8個(gè)堿基互補(bǔ)，否則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。7）引物3’末端堿基一定要與模板正確配對(duì)，引物3’端最佳堿基選擇是G和C。8）引物的5’端可以修飾，如：引入酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、用熒光素、生物素等標(biāo)記等9）引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。38ppt課件5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無(wú)嚴(yán)格限制。3’3’5’GC39ppt課件3.引物的使用要求

引物濃度要遠(yuǎn)高于模板濃度，一般每條引物的濃度0.1～0.5μmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

合適的退火溫度比引物本身的Tm低5℃，一般在55℃左右。40ppt課件（三）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是從一種水生棲嗜熱菌YT1株(一種嗜熱真菌)分離提取出來(lái)，該酶基因全長(zhǎng)2.49kb，編碼832個(gè)氨基酸。該酶雖然在90℃以上幾乎無(wú)DNA合成，但確有良好的熱穩(wěn)定性。（天然酶）另一類(lèi)通過(guò)基因工程合成的酶。（基因工程酶）

TaqDNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應(yīng)的前提條件，也是PCR反應(yīng)能迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的原因。41ppt課件(一)酶活性與熱穩(wěn)定性1）酶蛋白分子量94KDa，比活性200000∪/mg，Taq酶的濃度通常為1~2.5∪/l，太多浪費(fèi)并易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

2）熱穩(wěn)定性好：能耐受DNA變性時(shí)的高溫在92.5℃、95℃、97.5℃時(shí)，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分別經(jīng)130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。

PCR反應(yīng)時(shí)變性溫度為95℃～20sec，50個(gè)循環(huán)后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性。42ppt課件1）TaqDNA聚合酶是Mg2+

依賴性酶，對(duì)Mg2+

濃度非常敏感。2）Mg2+濃度2.0mmol/L時(shí)，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。3）Mg2+

能與dNTP結(jié)合而降低PCR反應(yīng)液中游離的Mg2+

濃度，優(yōu)化濃度一般反應(yīng)中Mg2+

濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L。4）適當(dāng)濃度的KCl能使TaqDNA聚合酶的催化活性提高50～60%。(二)離子依賴性43ppt課件1）TaqDNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和5′→3ˊ外切酶活性，而無(wú)3′→5′外切活性，在PCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯(cuò)配，該酶是沒(méi)有校正功能。TaqDNA聚合酶的堿基錯(cuò)配機(jī)率為2.1×10-4。2）TaqDNA聚合酶還具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性.(三)忠實(shí)性(四)Taq酶的最適溫度75~80℃每個(gè)酶分子可延伸約150個(gè)核苷酸/秒，70℃延伸率大于60個(gè)核苷酸/秒，55℃時(shí)為22個(gè)核苷酸/秒。最適溫度75℃左右。44ppt課件45ppt課件（四）原料原料：四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)：濃度為

20~200μmol/L。Mg2+：為T(mén)aq

酶的必需激活劑。

濃度為0.5~2.5mmol/L。太少：酶活性明顯降低；

太多：導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。（五）Mg2+46ppt課件反應(yīng)溫度和時(shí)間1.變性：

95℃，30”~1’

雙鏈DNA變成單鏈。2.退火：55℃，30”~1’

引物與模板互補(bǔ)結(jié)合。退火溫度對(duì)特異性影響很大。退火溫度=Tm值-(5～10℃)Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T）3.延伸：72~75℃，1’~2’Taq

酶催化dNTP，從引物3’-OH端開(kāi)始，與模板互補(bǔ)，合成一條新的DNA鏈。小于20bp片段47ppt課件反應(yīng)緩沖液：常用10mmol/LTris-HCl緩沖液，pH8.3~8.8為T(mén)aq

酶最適pH值。循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA的起始濃度，合適的循環(huán)數(shù)為25~30次。

循環(huán)數(shù)太少：產(chǎn)物量不多循環(huán)數(shù)太多：非特異性擴(kuò)增會(huì)增加，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)48ppt課件PCR反應(yīng)體系5×擴(kuò)增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙蒸水至50ul49ppt課件四、PCR常見(jiàn)問(wèn)題1.無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對(duì)樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太低延伸時(shí)間太短

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物提高退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間現(xiàn)象：對(duì)照組有條帶，而樣品則無(wú)；50ppt課件2.非特異性擴(kuò)增

現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。51ppt課件引物特異性差模板或引物濃度過(guò)高酶量過(guò)多Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過(guò)多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計(jì)引物適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低Mg2+濃度減少循環(huán)次數(shù)非特異性擴(kuò)增52ppt課件3.拖尾

現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈拖尾狀態(tài)。M1253ppt課件模板不純降解退火溫度偏低酶量過(guò)多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過(guò)多

原因?qū)Σ呒兓０甯淖儣l件適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和Mg2+的濃度減少循環(huán)次數(shù)拖尾54ppt課件4.假陽(yáng)性

原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物

對(duì)策：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。

55ppt課件五、PCR實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)由于PCR的靈敏性極高，故微量的樣品污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。所有的溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染采取的措施：

1）隔離不同的操作區(qū)

2）采用一次性用具

3）嚴(yán)格按無(wú)菌操作原則進(jìn)行

4）并設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照，以提高PCR結(jié)果的正確性。56ppt課件除實(shí)驗(yàn)樣品外，應(yīng)設(shè)幾種實(shí)驗(yàn)對(duì)照：1）陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性DNA模板參與的PCR反應(yīng)；陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本。2）陰性對(duì)照：無(wú)核酸模板參與的PCR反應(yīng)；在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)試劑是否污染。

57ppt課件示例電泳結(jié)果

12345MM：DNAmarker1：為陽(yáng)性對(duì)照2：為陰性對(duì)照3-5：為擴(kuò)增出的DNA條帶58ppt課件DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測(cè)人類(lèi)學(xué)研究……六、PCR技術(shù)的主要用途PCR59ppt課件利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段。1.目的基因的克隆60ppt課件大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因基因工程產(chǎn)品61ppt課件A’內(nèi)源性病變基因正常人A病人病原微生物基因正常人(-)病人(+)2.基因檢測(cè)62ppt課件遺傳病的診斷

基因缺失、插入或置換等地中海貧血珠蛋白鏈合成障礙，或珠蛋白的組分改變，功能降低63ppt課件A正常人病人正常病人64ppt課件ASO探針?lè)ú∪薃CTGASO探針正常PCR-ASO檢測(cè)基因點(diǎn)突變：主是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的適當(dāng)片段，然后用人工合成的含突變位點(diǎn)的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交65ppt課件探針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子66ppt課件PCR-RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)體）法：

限制性核酸內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因67ppt課件突變限制性核酸內(nèi)切酶68ppt課件正常突變電泳69ppt課件3.DNA和RNA的微量分析PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。

70ppt課件PCR后將待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；使用引物對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，就可摻入同位素或非同位素標(biāo)記的各種堿基，獲得所需比活性的探針。4.DNA序列測(cè)定5.用PCR標(biāo)記DNA探針71ppt課件mRNA

第二節(jié)常用幾種PCR反應(yīng)1)RNase2)堿性液(水解RNA)

單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶

(使dNTP

聚合)RNA-DNA雜化鏈PCR一、逆轉(zhuǎn)錄PCRDNA聚合酶雙鏈DNA(使dNTP

聚合)PCR72ppt課件二、實(shí)時(shí)PCR

實(shí)時(shí)PCR（real-time

polymerase

chain

reaction）又稱熒光定量PCR。是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

73ppt課件熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR，得到廣泛應(yīng)用。熒光定量PCR標(biāo)記方法：序列特異性探針：如

Taqman內(nèi)摻式染料：如SYBRGreenI74ppt課件PCR引物實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理75ppt課件引物之間一段帶有標(biāo)記寡核苷酸鏈，稱作探針76ppt課件報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)77ppt課件無(wú)熒光信號(hào)產(chǎn)生能量激發(fā)光完整的探針：5′端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3′端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移）

78ppt課件變性(95oC)79ppt課件退火(60oC)80ppt課件退火(60oC)81ppt課件82ppt課件83ppt課件?84ppt課件5′→3′外切酶活性將探針5′端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)85ppt課件86ppt課件87ppt課件88ppt課件89ppt課件90ppt課件91ppt課件92ppt課件93ppt課件94ppt課件95ppt課件實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記分子RQ

3'3'5'5'熒光報(bào)告分子熒光淬滅分子熒光信號(hào)96ppt課件SYBRGreenI作用機(jī)理EmissionEmission97ppt課件SYBRGreenI作用機(jī)理ExcitationEmission98ppt課件

原位PCR(InSituPCR,IS-PCR)是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性定量定位分析。即把原位雜交的細(xì)胞定位技術(shù)與PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)。三、原位PCR99ppt課件▲待檢標(biāo)本先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性，PCR擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物，DNA聚合酶，dNTP等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)。▲以