分子熒光光度法

關(guān)于分子熒光光度法第1頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三

第一節(jié)概述一、光致發(fā)光物質(zhì)分子吸收特定波長(zhǎng)的光能后，由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)分子是不穩(wěn)定的，可能通過(guò)輻射（發(fā)光）或非輻射的形式放出多余的能量，由激發(fā)態(tài)重新回到基態(tài)。物質(zhì)分子吸收外來(lái)光被激發(fā)后所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，叫光致發(fā)光。熒光10-9~10-6s實(shí)用磷光10-3~10s不實(shí)用二、熒光光度法利用測(cè)量熒光強(qiáng)度而建立起來(lái)的一類測(cè)定物質(zhì)含量的分析方法，稱為熒光光度法，即熒光法。

第2頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，10-7~10-9g/ml，比紫外分光光度法靈敏度高10~1000倍。第二節(jié)基本原理一、熒光的產(chǎn)生基態(tài)激發(fā)光激發(fā)態(tài)去激發(fā)基態(tài)（一）激發(fā)處于基態(tài)的物質(zhì)分子吸收光能時(shí)，其電子對(duì)中的一個(gè)電子被激發(fā)到某一較高能級(jí)。基態(tài)單重態(tài)所有電子都自旋配對(duì)的分子電子態(tài)。激發(fā)態(tài)激發(fā)單重態(tài)S1S2……

激發(fā)三重態(tài)T1T2……(二)去激發(fā)指分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射或非輻射方式回到基態(tài)的過(guò)程。第3頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三輻射躍遷

熒光去激發(fā)磷光振動(dòng)馳豫無(wú)輻射躍遷

內(nèi)轉(zhuǎn)移

（熱的形式）體系間跨越外轉(zhuǎn)移1、振動(dòng)馳豫

同一電子能級(jí)中，電子由高振動(dòng)能級(jí)躍遷到低振動(dòng)能級(jí)，并將能量以熱的形式傳遞給溶劑分子，這一過(guò)程稱振動(dòng)馳豫。2、內(nèi)轉(zhuǎn)移兩個(gè)相鄰電子能級(jí)相距較近，以致其振能級(jí)重疊時(shí)，電子由高電子能級(jí)躍遷至低電子能級(jí)，同時(shí)將能量以熱的形式傳遞給溶劑分子。第4頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三

意義：無(wú)論分子中的電子最初被激發(fā)至哪一激發(fā)單重態(tài)（如S1、S2、S3……)，它都能通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)移和振動(dòng)馳豫到達(dá)S1的最低振動(dòng)能級(jí)上。一般情況下，S1與S0之間很難發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)移；T1與S0之間發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)移的幾率要大些。3、體系間跨越

電子由激發(fā)單重態(tài)向激發(fā)三重態(tài)的無(wú)輻射躍遷稱為體系間跨越。常見(jiàn)于含重原子(I、Br)的有機(jī)分子中。4、外轉(zhuǎn)移

激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)相互作用，以熱的形式失去多余的能量回到基態(tài)，這一過(guò)程叫分子的外轉(zhuǎn)移。外轉(zhuǎn)移后，分子的熒光或磷光減弱或消失，稱“猝滅”或“熄滅”。磷光壽命長(zhǎng)，發(fā)生外轉(zhuǎn)移機(jī)率大，所以室溫下很難見(jiàn)到磷光。第5頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三

5、熒光發(fā)射

電子由第一激發(fā)單重態(tài)S1（最低振動(dòng)能級(jí)）躍遷至基態(tài)S0而發(fā)射的光叫熒光。6、磷光發(fā)射

電子由第一激發(fā)三重態(tài)T1躍遷至基態(tài)S0而發(fā)射的光叫磷光。

躍遷方式時(shí)間振動(dòng)馳豫10-12~10-14S

內(nèi)轉(zhuǎn)移10-11~10-13S

熒光10-6~10-9S

磷光10-4~10S第6頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、影響熒光的因素

熒光效率：

ψf=

發(fā)射熒光的分子數(shù)被激發(fā)的分子總數(shù)熒光效率越大，表示分子產(chǎn)生熒光的能力越強(qiáng)。1、分子結(jié)構(gòu)

(1)π→π*躍遷能產(chǎn)生較強(qiáng)熒光?！a(chǎn)生熒光的主要躍遷類型

(2)含π-π共軛體系的有機(jī)分子，電子共軛程度越大，熒光效率越大。

(3)剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)：隨分子的剛性和共平面性增加，電子共軛程度亦增加，熒光效率增大。

(4)取代基效應(yīng)：斥電子基→ψf↑

吸電子基→ψf↓

重原子→ψf↓第7頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、環(huán)境因素

(1)溫度溫度↑→熒光效率↓

(2)溶劑極性↑→熒光↑

(3)溶液pH值影響熒光物質(zhì)存在形式。因此要嚴(yán)格控制溶液pH值。

(4)熒光熄滅劑（鹵素離子、重金屬離子等等）3、熒光物質(zhì)濃度自熄滅：當(dāng)熒光物質(zhì)高到一定濃度時(shí)，熒光分子間碰撞增多，使熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。第8頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三原理圖熒光測(cè)量應(yīng)在垂直激發(fā)光方向上進(jìn)行。一、光源特點(diǎn)：光強(qiáng)度大，適用范圍寬。常用：高壓汞燈，氙燈，溴鎢燈，激光，脈沖激光二、單色器干涉濾光片，光柵三、樣品池石英杯四、檢測(cè)器光電倍增管第三節(jié)熒光光度計(jì)日立850型熒光分光光度計(jì)第9頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三第四節(jié)

定量分析方法原理：一定條件下，熒光強(qiáng)度（If)與濃度(c)呈線性關(guān)系。

If=Kc

定量分析的依據(jù)方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法第10頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三第五節(jié)分析條件的選擇線性范圍、激發(fā)光波長(zhǎng)、熒光波長(zhǎng)、散射光的排除一、線性范圍的選擇熒光物質(zhì)濃度較低時(shí)，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。二、選擇激發(fā)波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)1、激發(fā)波長(zhǎng)的選擇激發(fā)光譜：將光源發(fā)射的激發(fā)光用單色器單色后照射物質(zhì)，連續(xù)改變激發(fā)光波長(zhǎng)，固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，所得熒光強(qiáng)度-激發(fā)波長(zhǎng)圖譜，稱激發(fā)光譜。一般選擇最大激發(fā)波長(zhǎng)作為激發(fā)光波長(zhǎng)。第11頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、熒光波長(zhǎng)的選擇

熒光光譜：用最大激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)光照射熒光物質(zhì)時(shí)，依次測(cè)定所發(fā)射的各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，所得熒光強(qiáng)度-熒光波長(zhǎng)圖譜，稱為熒光光譜。一般選擇熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。三、散射光干擾的排除1、散射光當(dāng)用一束光照射溶液時(shí)，大部分光被吸收和透過(guò)，還有小部分被溶劑分子碰撞而向四面八方散射，這種光稱散射光。瑞利散射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)一樣拉曼散射光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)第12頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、消除方法（1）選擇適宜的激發(fā)光波長(zhǎng)用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射某一熒光物質(zhì)，所產(chǎn)生的熒光峰位波長(zhǎng)相同，但產(chǎn)生的拉曼散射光峰位各不相同。所以，可通過(guò)選擇某一適宜的激發(fā)波長(zhǎng)，使產(chǎn)生的拉曼散射光峰位遠(yuǎn)離熒光峰位而不干擾。（2）選擇合適的溶劑

拉曼散射光主要來(lái)源于溶劑。不同溶劑產(chǎn)生的拉曼散射光波長(zhǎng)不同，所以，通過(guò)選擇不同溶劑使散射光波長(zhǎng)遠(yuǎn)離熒光波長(zhǎng)，而消除其干擾作用。第13頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5月2日，星期三第六節(jié)應(yīng)用因熒光光度法具有靈敏度高、選擇性好、取樣量少等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)和衛(wèi)生防疫等領(lǐng)域。第14頁(yè)，講稿共20頁(yè)，2023年5