內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在T細(xì)胞活化誘導(dǎo)凋亡中的作用

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在T細(xì)胞活化誘導(dǎo)凋亡中的作用嚴(yán)成;金慧敏;顏楠楠滸潔消騰飛;周麗萍;邵啟祥;夏圣【摘要】目的:探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在T細(xì)胞活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(activation-inducedcelldeath,AICD)中的作用.方法:建立小鼠T淋巴瘤EL-4細(xì)胞和成年C57BL/6小鼠T細(xì)胞AICD的模型，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定發(fā)生AICD的細(xì)胞凋亡率;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同濃度CD3抗體對(duì)EL-4細(xì)胞AICD發(fā)生的影響;將小鼠AICD模型T細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、激動(dòng)組(加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑二硫蘇糖醇)、抑制組(加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果:EL-4細(xì)胞和C57BL/6小鼠T細(xì)胞發(fā)生AICD時(shí)細(xì)胞凋亡率升高;隨著CD3抗體濃度增加,EL-4細(xì)胞發(fā)生AICD的比例增加;激動(dòng)組小鼠T細(xì)胞發(fā)生AICD的比例增加,抑制組小鼠T細(xì)胞發(fā)生AICD的比例降低抑制劑組細(xì)胞凋亡水平較對(duì)照組降低結(jié)論:增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進(jìn)T細(xì)胞發(fā)生AICD,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可減少T細(xì)胞發(fā)生AICD.%Objective:Toexploretheroleofendoplasmicreticulum(ER)stressinactivation-inducedcelldeath(AICD)ofTcells.Methods:ThemodelofAICDwassetupbyusingEL-4cells(miceTlymphomacell)andtheTcellofadultC57BL/6mice,thecellapoptosisofAICDwasmeasuredbyflowcytometry.TheeffectofCD3antibodyconcentrationsonEL-4cellAICDwasassessedbyflowcytometry.FlowcytometrywasusedtoobserveandanalyzetheapoptoticcellsofagonistgroupwhichaddedwithERstressinducerdithiothreitolandinhibitiongroupwhichaddedwithERstressinhibitor4-phenylbutyricacidinTcellAICDofadultC57BL/6mice.Results:ThecellapoptosiswasincreasedwhenAICDformedinEL-4cellandTcellinC57BL/6mice.WiththeincreaseofCD3antibodyconcentration,theoccurrencerateofEL-4cellAICDincreased.DithiothreitolinducedtheoccurrenceofTcellAICDinmice,while4-phenylbutyricacidreducedtheoccurrenceofTcellAICDinmice.Conclusion:TheinductionofERstresscouldpromoteTcellAICD,whileinhibitionofERstressdecreaseTcellAICD.【期刊名稱】《江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)》【年(卷)，期】2017(027)003【總頁(yè)數(shù)】4頁(yè)(P205-208)【關(guān)鍵詞】?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;T細(xì)胞;活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡【作者】嚴(yán)成;金慧敏;顏楠楠滸潔消騰飛;周麗萍;邵啟祥;夏圣【作者單位】江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)教研室,江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所,江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)教研室，江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)教研室,江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)教研室,江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)教研室,江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)及檢驗(yàn)教研室，江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)教研室,江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)教研室,江蘇鎮(zhèn)江212013;江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】R392.12內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在新合成的跨膜蛋白和分泌蛋白的合成、折疊、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要的作用［1］。未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚積可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)一系列嚴(yán)重疾病，例如al-抗胰蛋白酶缺乏癥、1型糖尿病、克雅氏病和囊性纖維化［2-4］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)觸發(fā)一個(gè)適應(yīng)性反應(yīng)，稱為未折疊蛋白反應(yīng)，由三個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穿膜蛋白調(diào)控，即抑制物阻抗性酯酶1、RNA激活蛋白激酶的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類似激酶和激活作用轉(zhuǎn)錄因子［5］。通過(guò)提高與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊相關(guān)酶類和分子伴侶的水平，增強(qiáng)錯(cuò)誤蛋白的降解能力和減少蛋白的翻譯，可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回到穩(wěn)態(tài)［6］。T細(xì)胞受到抗原刺激時(shí)，大量增殖，活化成效應(yīng)T細(xì)胞，清除抗原，維持免疫穩(wěn)態(tài)。當(dāng)抗原清除后，機(jī)體可啟動(dòng)活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(activationinducedcelldeath,AICD)途徑，調(diào)控活化的T細(xì)胞凋亡，以免發(fā)生自身免疫性疾病。以往研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞發(fā)生凋亡的途徑之一［7］，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在T細(xì)胞AICD中的作用尚不清楚。本研究在建立AICD模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析，并應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)T細(xì)胞AICD的影響，以期進(jìn)一步了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在特異性細(xì)胞免疫中的調(diào)控機(jī)制。1.1研究對(duì)象小鼠T淋巴瘤EL-4細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；6~12周齡的雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，本實(shí)驗(yàn)室繁育后用于實(shí)驗(yàn)。1.2主要試劑和儀器RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（PAA公司），6孑L、24孑L、96孑L板（Nunc公司），4-苯基丁酸、DTT、刀豆蛋白A（Con-A,Sigma-Aldrich公司），重組小鼠IL-2蛋白、功能性大鼠來(lái)源的抗小鼠CD3抗體（eBioscience公司），Annexin-V-FITC、7-AAD、CD4-PE（eBioscience公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化廠），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma公司），倒置式生物顯微鏡（Nikon公司），臺(tái)式離心機(jī)（Thermo公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD公司）。1.3EL-4細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞體外誘導(dǎo)AICD將C57BL/6小鼠處死后，取脾臟，制備成單細(xì)胞懸液，以2x105細(xì)胞密度加入到96孔板，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)。先用Con-A（5mg/L）刺激活化48h，再加入IL-2（10pg/L）培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，以2.5x105細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至已用CD3（1mg/L）包被的96孔板，培養(yǎng)24h,體外誘導(dǎo)AICD。將熒光素標(biāo)記的Annexin-V-FITC、7-AAD和CD4-PE分別加入細(xì)胞液。標(biāo)記完成后，用PBS洗細(xì)胞2遍，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的熒光信號(hào)，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。EL-4細(xì)胞的AICD誘導(dǎo)采用相同方法。1.4不同濃度CD3抗體對(duì)EL-4細(xì)胞AICD的影響經(jīng)過(guò)Con-A和IL-2活化的EL-4細(xì)胞轉(zhuǎn)移到CD3抗體包被的96孔板培養(yǎng)時(shí)，將CD3抗體的包被濃度分為0、1、5、10mg/L，培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，采用“1.3”中所述的AICD流式檢測(cè)法進(jìn)行熒光標(biāo)記抗體等標(biāo)記后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的熒光信號(hào)，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。1.5小鼠T細(xì)胞AICD的分組及處理將小鼠T細(xì)胞分為4組，對(duì)照組未行AICD誘導(dǎo)，模型組行AICD誘導(dǎo)，抑制組在誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸，激動(dòng)組在誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑DTT。經(jīng)Con-A和IL-2活化的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至CD3抗體包被的96孔板培養(yǎng)，同時(shí)激動(dòng)組、抑制組中分別加入DTT或4-苯基丁酸（終濃度1mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，采用“1.3”所述的AICD流式檢測(cè)法進(jìn)行熒光標(biāo)記抗體等標(biāo)記后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的熒光信號(hào)，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。2.1EL-4細(xì)胞AICD體外誘導(dǎo)模型的鑒定如圖1所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠T淋巴瘤EL-4細(xì)胞株凋亡率明顯增高，達(dá)28.5%，說(shuō)明用Con-A結(jié)合IL-2和CD3抗體可成功誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞發(fā)生AICD。EL-4細(xì)胞活化后，大量細(xì)胞聚集成團(tuán)；經(jīng)誘導(dǎo)凋亡后，細(xì)胞體積縮小，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整。2.2小鼠CD4+T細(xì)胞AICD體外誘導(dǎo)模型的鑒定如圖2所示，小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)、活化后發(fā)生AICD;與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率明顯增高，達(dá)71.16%。2.3不同濃度CD3抗體對(duì)T細(xì)胞AICD發(fā)生的影響結(jié)果顯示（圖3）,CD3濃度為1mg/L時(shí)，可誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞發(fā)生AICD。當(dāng)CD3濃度增至5mg/L時(shí)，EL-4細(xì)胞發(fā)生AICD的比例增加，但幅度不大；而CD3濃度增至10mg/L,EL-4細(xì)胞發(fā)生AICD的比例較1mg/L明顯增加，由27.7%增加至39.4%。2.4內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)T細(xì)胞AICD的影響結(jié)果顯示（圖4）,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活可致CD4+T細(xì)胞凋亡率明顯升高。與對(duì)照組相比，激動(dòng)組存活的CD4+T細(xì)胞群體明顯降低。相反，抑制組CD4+T細(xì)胞凋亡率（68.46%）明顯低于激動(dòng)組（89.70%）和模型組（79.19%）。AICD對(duì)免疫穩(wěn)態(tài)的維持必不可少。多項(xiàng)研究表明，在免疫系統(tǒng)中，機(jī)體可通過(guò)發(fā)生AICD來(lái)調(diào)控活化的T細(xì)胞存活或凋亡，以防止釋放有害細(xì)胞因子的活化T細(xì)胞過(guò)度聚積，從而調(diào)節(jié)自身的細(xì)胞免疫反應(yīng)。如若AICD不能順利進(jìn)行，將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生系統(tǒng)性自身免疫性和淋巴細(xì)胞積累的淋巴增殖性疾?。?-9］。本文應(yīng)用Con-A結(jié)合IL-2和CD3抗體的方法，成功誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生AICD，且隨著CD3抗體濃度的增加，T細(xì)胞發(fā)生AICD的比例也增加，說(shuō)明更強(qiáng)的細(xì)胞受體強(qiáng)度交聯(lián)支持細(xì)胞死亡超過(guò)細(xì)胞的激活，而較弱的初始細(xì)胞刺激沒(méi)有觸發(fā)細(xì)胞死亡導(dǎo)致T細(xì)胞活化。在細(xì)胞死亡、分化和環(huán)境刺激的過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)承擔(dān)著不同程度的蛋白折疊負(fù)荷［10］。研究表明，不管在體內(nèi)或體外，4-苯基丁酸可減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，阻斷神經(jīng)性疼痛、保護(hù)大腦，以免發(fā)生腦缺血性損傷和防止心臟纖維化［11-12］。而DTT可以誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白錯(cuò)誤折疊，從而發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑DTT可增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞凋亡，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸則明顯抑制CD4+T細(xì)胞凋亡，說(shuō)明抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，T細(xì)胞的AICD過(guò)程受到抑制。由此說(shuō)明，在T細(xì)胞發(fā)生AICD時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起重要作用。有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也與輔助性T細(xì)胞的分化有關(guān)［14-15］。而抗腫瘤T細(xì)胞過(guò)早發(fā)生AICD會(huì)導(dǎo)致以T細(xì)胞為主的免疫監(jiān)視功能受限［16］。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以是—個(gè)免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，可通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活，進(jìn)而調(diào)控T細(xì)胞的生物學(xué)功能，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)。細(xì)胞凋亡過(guò)程涉及多種凋亡配體：凋亡相關(guān)因子配體、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體、腫瘤壞死因子相關(guān)弱凋亡的誘導(dǎo)物及其相關(guān)受體［17-18］。本實(shí)驗(yàn)室最近利用定向敲除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重要分子Sel1L小鼠T細(xì)胞進(jìn)行的AICD誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在定向敲除Sel1L小鼠T細(xì)胞中，AICD的發(fā)生率明顯降低，說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白折疊及未折疊蛋白反應(yīng)可影響T細(xì)胞功能（未發(fā)表）。但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具體通過(guò)自身哪種途徑影響T細(xì)胞的凋亡，以及影響哪種凋亡相關(guān)配體和受體等詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，還需行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。［1］BegumG,HarveyL,DixonCE,etal.ERstressandeffectsofDHAasanERstressinhibitor[J].TranslStrokeRes,2013,4(6):635-642.[2]OsorioF,TavernierSJ,HoffmannE,etal.Theunfolded-protein-responsesensorIRE-1aregulatesthefunctionofCD8a+dendriticcells[J].NatImmunol,2014,15(3):248-257.[3]ChitiF,DobsonCM.Proteinmisfolding,functionalamyloid,andhumandisease[J].AnnuRevBiochem,2006,75:333-366.[4]SunS,ShiG,HanX,etal.Sel1Lisindispensableformammalianendoplasmicreticulum-associateddegradation,endoplasmicreticulumhomeostasis,andsurvival[J].ProcNatlAcadSciUSA,2014,111(5):E582-E591.[5]HiramatsuN,ChiangWC,KurtTD,etal.Multiplemechanismsofunfoldedproteinresponse-inducedcelldeath[J].AmJPathol,2015,185(7):1800-1808.[6]SanoR,ReedJC.ERstress-inducedcelldeathmechanisms[J].BiochimBiophysActa,2013,1833(12):3460-3470.[7]FribleyA,ZhangK,KaufmanRJ.Regulationofapoptosisbytheunfoldedproteinresponse[J].MethodsMolBiol,2009,559:191-204.[8]XuY,ZhaoF,QiuQ,etal.TheERmembrane-anchoredubiquitinligaseHrd1isapositiveregulatorofT-cellimmunity[J].NatCommun,2016,7:12073.[9]SalmenaL,LemmersB,HakemA,etal.Essentialroleforcaspase8inT-cellhomeostasisandT-cell-mediatedimmunity[J].GenesDev,2003,17(7):883-895.[10]ZhangK,KaufmanRJ.Theunfoldedproteinresponse:astresssignalingpathwaycriticalforhealthanddisease[J].Neurology,2006,66(2suppl1):S102-S109.[11]ZhouF,ZhangW,ZhouJ,etal.Involvementofendoplasmicreticulumstressinformalin-inducedpainisattenuatedby4-phenylbutyricacid[J].JPainRes,2017,10:653-662.[12]InceogluB,BettaiebA,TrindadedaSilvaCA,etal.Endoplasmicreticulumstressintheperipheralnervoussystemisasignificantdriverofneuropathicpain[J].ProcNatlAcadSciUSA,2015,112(29):9082-9087.[13]ChengZ,RendlemanJ,VogelC.Time-courseproteomicsdatasetmonitoringHeLacellssubjectedtoDTTinducedendoplasmicreticulumstress[J].DataBrief,2016,8:1168-1172.[14]ZhengM,ZhangQ,JoeY,etal.CurcumininducesapoptoticcelldeathofactivatedhumanCD4+