環(huán)境生物技術(shù)講座北大

微生物在處理水、廢水、污泥以及受污染場地的生物修復(fù)中得到了廣泛的應(yīng)用。但是，生物處理過程中經(jīng)常出現(xiàn)一些故障，例如，活性污泥處理廢水過程中的污泥膨脹，厭氧消化過程中的過度酸化現(xiàn)象等，使處理工藝難以發(fā)揮最佳功效。人們對這些過程中微生物種群的組成、各種微生物所起的作用以及它們之間的相互關(guān)系尚缺乏深刻的認識。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第1頁；編輯于星期二\17點28分

傳統(tǒng)的基于微生物培養(yǎng)和純種分離的技術(shù)在研究微生物生態(tài)、描述微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性時存在諸多局限性，主要表現(xiàn)為：（1）對微生物類群進行描述之前必須首先進行培養(yǎng)，然而自然生境中的微生物，其大部分種類至今為止是不可培養(yǎng)的。（2）現(xiàn)有微生物分類標準具有主觀性。即使某些新發(fā)現(xiàn)的微生物種可以被培養(yǎng)，但往往與現(xiàn)行的分類標準體系不相符，而已有的對各種微生物表型的描述也常常不能滿足區(qū)分各種類群的需要。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第2頁；編輯于星期二\17點28分

基于現(xiàn)代生物學(xué)的分子方法，為深入研究廢水生物處理過程中各種微生物的作用，為深刻理解廢水處理過程的本質(zhì)、提高處理系統(tǒng)的性能以及進行工藝革新等提供了新的強有力的方法和手段，為我們了解這些處理系統(tǒng)中的微生物生態(tài)并對處理過程進行工程控制提供了可能。分子生物學(xué)方法的出現(xiàn)使我們有可能更好的理解現(xiàn)有的生物處理工藝（如活性污泥法、厭氧污泥消化）以及開發(fā)新的處理工藝。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第3頁；編輯于星期二\17點28分利用分子生物學(xué)方法可以直接獲得活性污泥中微生物種群的基因信息，可以為我們提供傳統(tǒng)的測量指標，如生化需氧量（BOD）、揮發(fā)性懸浮固體（VSS）等所不能反映的一些精確信息。分子生物學(xué)方法可以跟蹤活性污泥中一些關(guān)鍵性的微生物，如絲狀菌、氨氧化菌等。我們將介紹常用的分子生物學(xué)方法在廢水生物處理微生物學(xué)研究中的一些成果及最新進展，包括微生物的原位檢測和定量分析、廢水處理系統(tǒng)中微生物的多樣性、與污泥膨脹和產(chǎn)生泡沫有關(guān)的細菌以及脫氮除磷微生物等。2001-12-8本文檔共69頁；當前第4頁；編輯于星期二\17點28分分子生物學(xué)方法可以直接探詢微生物種群中我們感興趣微生物的基因信息，而這些信息是傳統(tǒng)的分析方法不可能獲得的。利用分子生物學(xué)方法可以省去對微生物的選擇培養(yǎng)以及利用形態(tài)特征進行鑒定微生物存在的偏差。本節(jié)主要內(nèi)容1.1分子方法探詢的基因目標1.2以rRNA為基因目標的優(yōu)點1.3分子信息及其應(yīng)用1分子生物學(xué)方法可以提供新的信息2001-12-8本文檔共69頁；當前第5頁；編輯于星期二\17點28分與建立在某些表型特性基礎(chǔ)上的細胞富集培養(yǎng)方法不同，分子方法直接針對微生物群落的基因信息，分子技術(shù)測定的是細胞DNA或RNA的堿基序列。

分子方法以不同類型的DNA或RNA為目標，這取決于我們需要哪種信息。表1總結(jié)了檢測目標以及每個目標能夠提供的信息。1.1分子方法探詢的基因目標2001-12-8本文檔共69頁；當前第6頁；編輯于星期二\17點28分目標獲得的信息核糖體（r）RNA系統(tǒng)發(fā)育身份，它們是什么？DNA上編碼rRNA的基因系統(tǒng)發(fā)育身份，它們是什么？DNA上的其他基因表型潛力，它們能夠做什么？信使（m）RNA表型活性，它們正在做什么？蛋白質(zhì)或其他報告產(chǎn)物表型活性或發(fā)育系統(tǒng)身份，它們是什么？或它們正在做什么？表1分子生物學(xué)方法探詢的目標

2001-12-8本文檔共69頁；當前第7頁；編輯于星期二\17點28分為了確定群落中的微生物在系統(tǒng)發(fā)育上的身份，以rRNA（通常是16SrRNA）或用于編碼rRNA的基因為分子檢測的目標。表型潛力，如對某種特殊基質(zhì)的降解能力，可以通過在DNA上尋找相關(guān)基因來進行檢測。已經(jīng)得到表達的表型潛力可以通過檢測mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物（如酶）來證明。根據(jù)我們的研究需要，可以利用適當?shù)姆肿臃椒▉硖皆儽?給出的基因目標，從這些基因分析中我們可以得到所需的信息?；蛱皆兊哪繕巳鐖D1所示。圖1總結(jié)了微生物細胞如何將DNA中的遺傳密碼轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)分子的機制。2001-12-8本文檔共69頁；當前第8頁；編輯于星期二\17點28分復(fù)制基因轉(zhuǎn)錄信使RNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物翻譯氨基酸—轉(zhuǎn)運RNA微生物細胞內(nèi)的信息流動示意圖DNA,mRNA,rRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)物均可以作為分子方法探詢的基因目標。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第9頁；編輯于星期二\17點28分1.2以rRNA為基因目標的優(yōu)點

核糖體RNA（rRNA）是目前用于構(gòu)建生物系統(tǒng)發(fā)育樹比較可靠的基因目標，可以為我們提供微生物群落中某一特定微生物豐度方面的信息。目前人們最常用的基因目標是rRNA，這是基于以下原因。2001-12-8本文檔共69頁；當前第10頁；編輯于星期二\17點28分（1）生物細胞需要rRNA將遺傳信息翻譯成蛋白質(zhì)，因此，rRNA存在于所有的生物細胞中；（2）生物細胞內(nèi)含有大量的核糖體，因此，rRNA相對來說容易檢測到；（3）由于rRNA被包埋于核糖體中，因而相對較為穩(wěn)定；（4）細菌和古細菌的小亞單位rRNA，即通常所說的16SrRNA，大約含1600個堿基對，這1600個堿基對可以提供足夠的進化信息，從中選擇15-20個堿基對序列的寡核苷酸片段用作探針，可以檢測和鑒定多種微生物；（5）從環(huán)境樣品中分離出rRNA并用于微生物系統(tǒng)發(fā)育、種類鑒定、多態(tài)性及多樣性研究的方法已全面建立。利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法總結(jié)如圖2。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第11頁；編輯于星期二\17點28分利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法

2001-12-8本文檔共69頁；當前第12頁；編輯于星期二\17點28分1.3分子信息及其應(yīng)用

從圖1可以看出，微生物細胞擁有一個復(fù)雜的信息流動網(wǎng)絡(luò)，并用來決定其類型和控制其行為。這些信息在DNA中編碼。DNA編碼的基因并不實際承擔(dān)任何細胞工作，如能量產(chǎn)生或合成。相反，它們通過精確的、多步驟機制解碼DNA上的信息，并最終生成各種工作分子，如催化細胞內(nèi)生化反應(yīng)需要的酶。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第13頁；編輯于星期二\17點28分目前常用的分子方法有:2.1核酸雜交2.2變性梯度凝膠電泳2.3限制性片段長度多態(tài)性2.4報告基因法2常用的分子生物學(xué)方法2001-12-8本文檔共69頁；當前第14頁；編輯于星期二\17點28分2.1核酸分子雜交技術(shù)探針是能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性結(jié)合的己知堿基序列的核酸片段。它可以是長探針（100-1000bp），也可以是短核苷酸片段（10-50bp），可以是從RNA制備的cDNA探針，也可以是PCR產(chǎn)物或人工合成的寡核苷酸探針。探針既可用放射性核苷酸標記，也可用非放射性分子標記。核酸分子雜交的高度特異性以及檢測方法的高度靈敏性，使核酸分子雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測環(huán)境中的微生物，并對它們的存在、分布、豐度和適應(yīng)性等進行定性和定量分析。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第15頁；編輯于星期二\17點28分

核酸雜交的主要步驟是核酸分子的變性和選擇性退火。雙鏈DNA或處于二級結(jié)構(gòu)的RNA分子通過變性回復(fù)到它們原來的單鏈、線性形式，從而使它們處于能與互補的核苷酸鏈退火雜交的狀態(tài)。雜交實驗中所用到的核酸探針通常以需要檢測的核酸序列為基礎(chǔ)，它們可以來自DNA、RNA、寡核苷酸或cDNA等。2001-12-8本文檔共69頁；當前第16頁；編輯于星期二\17點28分核酸雜交以堿基配對原理為基礎(chǔ)，利用寡核苷酸探針與靶細胞專一性結(jié)合進行生物分析。核酸雜交的基本實驗步驟為：細胞固定、雜交（專一性和嚴格性依賴于雜交溫度和時間、鹽濃度、探針長度及其濃度）、洗脫（去除與靶細胞沒有結(jié)合和非專一性結(jié)合的物質(zhì)）和檢測，如下圖所示。2001-12-8本文檔共69頁；當前第17頁；編輯于星期二\17點28分核酸雜交的步驟

2001-12-8本文檔共69頁；當前第18頁；編輯于星期二\17點28分核酸雜交試驗并不要求探針與目標核酸序列之間百分之百地互補。有限數(shù)目的非互補堿基對的存在是可以接受的。互補的單鏈核苷酸分子經(jīng)退火形成核酸雙鏈分子的過程是可逆的。因此，可以通過改變反應(yīng)的物理和化學(xué)環(huán)境（條件）從而增加核酸雙鏈分子生成的速度、程度及其穩(wěn)定性。影響兩段互補核苷酸鏈雜交的因素包括：雜交和洗膜的溫度、雜交時間、離子強度、甲酰胺濃度、堿基對之間非互補的程度以及探針分子和靶核酸序列的長度、復(fù)雜性和濃度等。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第19頁；編輯于星期二\17點28分利用核酸雜交技術(shù)研究環(huán)境樣品中的微生物具有以下優(yōu)點：（1）核酸可以直接從樣品中提取，不必對微生物進行培養(yǎng)；（2）不管基因表達與否，都可以檢測到特定的基因或核酸序列，從而能準確地跟蹤、監(jiān)測特定的微生物種群。通常，一份環(huán)境樣品中可能只有一小部分的微生物類群在迅速生長，因而也只有一小部分的基因在活躍表達，在這種情況下，核酸雜交技術(shù)的這一優(yōu)點更加明顯；（3）利用同一樣品可以同時檢測到眾多不同的微生物類群。實際上，核酸雜交的檢測效率隨著所分析的微生物類群的增加而提高；（4）由于可以直接檢測到特定的核酸序列，因此該方法并不要求一定要有選擇性表型（即突變衍生物），這就避免了野生種的生態(tài)適應(yīng)性被營養(yǎng)缺陷型所抵消的問題。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第20頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第21頁；編輯于星期二\17點28分

核酸雜交技術(shù)在環(huán)境中應(yīng)用的一個重要局限就是它要比傳統(tǒng)的方法復(fù)雜得多。（1）從各種環(huán)境樣品中提取核酸本身就包含眾多繁冗的抽提和純化操作，因此也是最復(fù)雜的步驟之一。（2）從富含能干擾核酸檢測的污染物的樣品（如土壤）中回收核酸，仍有待用一些特殊的技巧對現(xiàn)行的有關(guān)方法加以改善。（3）對任何一個自然微生物群落的研究常常需要對其多個平行樣品進行分析和統(tǒng)計，而目前要用核酸雜交技術(shù)分析如此眾多的樣品實際上相當困難。準確估算樣品中有關(guān)基因的拷貝數(shù)的方法尚有待進一步建立。（4）從諸如水樣等樣品中檢測到以很低豐度存在的、或在整個微生物群落中僅占很小比例的微生物類群，核酸雜交技術(shù)的靈敏度尚需大幅度提高。而要將特定的微生物或核酸序列從富含與它親緣關(guān)系較近的其它微生物的背景中檢測出來，也要求一些特殊的方法。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第22頁；編輯于星期二\17點28分核酸雜交技術(shù)的一個缺點是只有對已被分離并已測序的微生物才能夠放心使用。微生物生態(tài)學(xué)家估計在自然界中到目前為止，只有少數(shù)微生物能夠被分離、培養(yǎng)。此外，被分離的微生物也可能并不能很好地代表自然環(huán)境中最重要的微生物。無論微生物是否已被分離或已完成測序，具有能提供微生物群落多樣性指紋信息的分子技術(shù)是非常有用的。2001-12-8本文檔共69頁；當前第23頁；編輯于星期二\17點28分變性梯度凝膠電泳法（DGGE）是一種使用日益廣泛的方法。在DGGE方法中，DNA在含聚丙烯酰胺凝膠電泳池的一端。電泳池兩端的電極形成一個電場，吸引帶負電的DNA向正極運動。DNA分子的移動速率取決于其分子大小與帶電量之間的比值，因此，不同的DNA分子運動到兩個電極之間的不同位置上停下，從而形成具有指紋作用的DNA帶。將DNA帶從凝膠中分離出來，可以進行進一步的擴增及測序。

2.2變性梯度凝膠電泳法（DGGE）2001-12-8本文檔共69頁；當前第24頁；編輯于星期二\17點28分DGGE法的原理如果不斷增加溫度或用化學(xué)變性劑處理，DNA雙鏈分子的兩條鏈就會開始分開（解鏈）。首先解鏈的區(qū)域由解鏈溫度較低的堿基組成。G.C堿基對比A.T堿基對結(jié)合得要牢固，因此G.C含量高的區(qū)域具有較高的解鏈溫度。同時影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力（稱作“堆積”）。解鏈溫度低的區(qū)域，通常位于端部，稱作低溫解鏈區(qū)（lowermeltingdomain）。如果端部分開，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區(qū)域便稱作高溫解鏈（highmeltingdomain）(下圖)。如果溫度或變性劑濃度繼續(xù)升高，兩條鏈就會完全分開。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第25頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第26頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第27頁；編輯于星期二\17點28分限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析是另一種指紋分析方法。該法利用限制性內(nèi)切核酸酶將被擴增的DNA切成片段，限制性酶對DNA的剪切能避開靶基因區(qū)。靶基因周圍的側(cè)翼區(qū)中具有不同數(shù)目的酶切位點。因此，限制性酶切后得到的DNA片段的大小不同，能夠通過電泳分離。

2.3限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）2001-12-8本文檔共69頁；當前第28頁；編輯于星期二\17點28分報告基因法為評價已表達的表型潛力提供了另一條途徑。在報告基因法中，利用重組技術(shù)將報告基因插入DNA分子上的目標區(qū)域。當DNA序列被轉(zhuǎn)錄時，報告基因也同時被轉(zhuǎn)錄。來自報告基因的mRNA被翻譯成能催化某些易于檢測的反應(yīng)的酶。發(fā)光是最常見的報告基因效應(yīng)，其中綠色熒光蛋白（GFP）最為常用。只有當完整序列被轉(zhuǎn)錄時才能觀察到報告基因效應(yīng)，因此，報告基因的表達意味著目標基因的表達。報告基因法可以對已表達的表型進行實時測定，其應(yīng)用前景十分可觀。2.4報告基因法2001-12-8本文檔共69頁；當前第29頁；編輯于星期二\17點28分GFP

綠色熒光蛋白作為新一代的基因轉(zhuǎn)移報告物或定位標記物，在環(huán)境微生物研究中越來越受到關(guān)注，GFP的優(yōu)點：（1）不需加任何底物，經(jīng)激發(fā)后即可產(chǎn)生熒光，且熒光性質(zhì)穩(wěn)定；（2）相對分子質(zhì)量小，對細胞無毒性；（3）檢測方便，可對活細胞進行實時定位觀察；（4）已有多種GFP突變蛋白，熒光特性得到明顯改善。2001-12-8本文檔共69頁；當前第30頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第31頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第32頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第33頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第34頁；編輯于星期二\17點28分3.1活性污泥中微生物多樣性研究3.2絲狀細菌的研究3.3脫氮微生物的研究3.4除磷微生物的研究3分子方法的應(yīng)用2001-12-8本文檔共69頁；當前第35頁；編輯于星期二\17點28分自1995年以來，基于16SrRNA基因庫分析，人們對活性污泥和生物膜處理系統(tǒng)中微生物多樣性進行了較廣泛的研究。大量的16SrRNA基因序列研究表明，這些處理系統(tǒng)中最常出現(xiàn)的微生物主要有-、-和-Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria。這些發(fā)現(xiàn)與利用熒光原位雜交（FISH）研究活性污泥系統(tǒng)得出的結(jié)果一致。利用16SrRNA數(shù)據(jù)庫還可以預(yù)測在所分析的系統(tǒng)中存在的細菌種屬。盡管從廢水處理反應(yīng)器中得到的16SrRNA基因克隆非常多，但是，對于實際廢水處理廠的微生物分析還沒有足夠的數(shù)據(jù)。

3.1活性污泥中微生物多樣性的研究

2001-12-8本文檔共69頁；當前第36頁；編輯于星期二\17點28分此外，一些復(fù)雜系統(tǒng)中實際的微生物種群組成不能夠僅僅根據(jù)16SrRNA基因庫來推測，而必須根據(jù)定量FISH分析結(jié)果來確定。定量FISH方法還很少用于研究實際廢水處理廠中微生物的種群結(jié)構(gòu)，這可能是由于對不同探針標記的微生物在顯微鏡下進行計數(shù)非常費事，且技術(shù)上也有一些困難。半自動數(shù)字圖像分析方法極大地加快了定量FISH的分析速度，并且使微生物學(xué)家第一次得到了活性污泥中微生物種群組成的高清晰度的、完整的圖像。2001-12-8本文檔共69頁；當前第37頁；編輯于星期二\17點28分3.2

絲狀細菌的研究

在活性污泥中存在一定數(shù)量的絲狀菌對于污泥絮體的形成是重要的，但是，出現(xiàn)大量的絲狀菌對于廢水處理則是有害的，因為它們會導(dǎo)致在污泥中形成泡沫、或者使二沉池中活性污泥的沉降性變差（引起污泥膨脹）。許多絲狀細菌難于培養(yǎng)，因此，人們對于絲狀菌了解不多，目前僅有一些在顯微鏡下可以觀察到的特征。據(jù)報道，人們在處理生活污水的廢水處理廠觀察到了30多種不同形態(tài)特征的絲狀菌，在處理工業(yè)廢水的活性污泥廠又觀察到了約40多種其他形態(tài)特征的絲狀菌。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第38頁；編輯于星期二\17點28分利用透視電子顯微鏡（TEM）和定量FISH技術(shù)可以研究活性污泥中的絲狀菌。利用顯微操作技術(shù)富集和分離絲狀微生物，然后進行16SrRNA基因序列分析。研究結(jié)果清楚地表明，一些分類學(xué)上相距較遠的細菌通常具有在光學(xué)顯微鏡下難于分辨的相同形態(tài)特征。因此，對絲狀菌根據(jù)其形態(tài)特征進行分類提出了強烈的置疑。在活性污泥中，有些絲狀菌可以呈現(xiàn)出非絲狀菌的生長形式。因此，僅僅根據(jù)形態(tài)特征進行鑒定有時是不可靠的。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第39頁；編輯于星期二\17點28分基于絲狀菌的16SrRNA基因序列，人們開發(fā)出了一套用于直接鑒定活性污泥中絲狀菌的定向于rRNA的寡核苷酸探針。利用寡核苷酸探針和抗體染色技術(shù)，可以定量地研究活性污泥中絲狀菌與污泥形成泡沫的關(guān)系。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第40頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第41頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第42頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第43頁；編輯于星期二\17點28分改進絲狀菌的原位鑒定和定量分析方法，開發(fā)絲狀菌的有效控制技術(shù)，都需要進一步了解這些微生物生態(tài)生理方面的知識。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第44頁；編輯于星期二\17點28分氨氮是生活污水中主要的含氮化合物（尿素極易水解形成氨），在污水處理廠中通過微生物的硝化和反硝化作用去除。盡管在教科書中仍然認為，Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterspp.是主要的氨氧化細菌和亞硝酸氧化細菌，但是，實際情況要復(fù)雜得多。

3.3

脫氮微生物的研究

2001-12-8本文檔共69頁；當前第45頁；編輯于星期二\17點28分氨氧化過程涉及的酶

NH4+

氧化為NO2-的過程需要經(jīng)過2個步驟：

2H++NH4++2e-+O2NH2OH+H2O+2H+NH2OH+H2OHONO+4e-+4H+上述2個反應(yīng)分別由氨單氧合酶（ammoniamonooxygenase，AMO）和羥胺氧化還原酶（hydroxylamineoxidoreductase，HAO）催化，其中AMO催化NH3

氧化為NH2OH的反應(yīng)，HAO催化NH2OH氧化為NO2-的反應(yīng)（見圖）。在細胞內(nèi)（invivo）和細胞外（invitro）進行的一系列研究使我們獲得了關(guān)于AMO和HAO的結(jié)構(gòu)與活性方面的大量信息。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第46頁；編輯于星期二\17點28分氨氧化途徑及其相關(guān)基因

2001-12-8本文檔共69頁；當前第47頁；編輯于星期二\17點28分氨單氧合酶（AMO）

AMO是一種細胞膜結(jié)合酶，類似于顆粒甲烷單氧合酶（pMMO）。許多間接證據(jù)表明，在N.europaea以及其它可能的Proteobacteria的L和Q亞類自養(yǎng)菌中，AMO包含3個亞單位，AMO-A,AMO-B和AMO-C，其結(jié)構(gòu)和大小各不相同，位于細胞的細胞膜/壁膜間隙中。在含14C標記的14C2H2中培養(yǎng)N.europaea細胞時，AMO的活性會喪失，一個27-kDa的多肽（AmoA）被標記。因此，人們認為AmoA中有氧化NH3的催化位點。對N.europaea中編碼氨單氧合酶的基因測序結(jié)果表明，第2個多肽（AmoB;38kDa）可以與AmoA一起純化。關(guān)于AMO的第3個多肽（AmoC;31.4kDa）的信息是間接的。對Nitrosomonaseuropaea和Nitrosospirasp.NpAV中amoC，amoA,和amoB基因的轉(zhuǎn)錄研究結(jié)果表明，AmoC，AmoA和AmoB的基因一起轉(zhuǎn)錄到單鏈mRNA中。2001-12-8本文檔共69頁；當前第48頁；編輯于星期二\17點28分AMO除可以氧化NH3以外，還可以氧化一系列的底物，將C-H鍵氧化成醇，將C=C鍵氧化成環(huán)氧化合物。反應(yīng)底物包括烷烴、芳烴、鹵代烴等。這為生物修復(fù)受氯代烴污染的環(huán)境提供了一種新的途徑。2001-12-8本文檔共69頁；當前第49頁；編輯于星期二\17點28分Nitrosomonas細胞內(nèi)由AMO催化的幾種反應(yīng)

2001-12-8本文檔共69頁；當前第50頁；編輯于星期二\17點28分羥胺氧化還原酶（HAO）

羥胺氧化還原酶的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，該酶以溶解態(tài)位于壁膜間隙，但定位在胞質(zhì)膜中，為64-kDa亞單位的同源三聚體，每一個亞單位包含8個c-型的血紅素。其中7個血紅素通過c-型的血紅素典型的硫醚鍵與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。第8個血紅素為P460，另外還有一個通過酪氨酸殘基與蛋白質(zhì)相連的共價鍵，位于NH2OH氧化的活性部位。HAO的晶體結(jié)構(gòu)顯示了每一個亞基中血紅素的定向以及電子在酶中流動的潛在途徑。2001-12-8本文檔共69頁；當前第51頁；編輯于星期二\17點28分在AMO催化的反應(yīng)中，O2中的一個O原子插入NH3分子中，另一個O原子被還原成H2O，該反應(yīng)需要2個額外的電子。因為NH3分子是這些細菌的唯一還原劑來源，所以生成H2O分子需要的電子必須來自NH2OH分子的隨后氧化。在HAO催化氧化NH2OH分子過程中釋放的4個電子中，2個電子流向NH3的氧化，剩下的2個電子用于其他的需要還原劑的細胞過程，如細胞生物合成和ATP的形成。2001-12-8本文檔共69頁；當前第52頁；編輯于星期二\17點28分酶功能的調(diào)節(jié)

氨氧化代謝產(chǎn)物NO2-對Nitrosomonaseuropaea

細胞中AMO活性的影響研究結(jié)果表明，NO2-對AMO活性有抑制作用，從而對Nitrosomonaseuropaea細胞產(chǎn)生毒性作用。Nitrosomonaseuropaea細胞中的亞硝酸鹽還原酶（nitritereductase，NirK）并不是產(chǎn)生氣體氮氧化物所必需的。借助于周質(zhì)的含銅亞硝酸鹽還原酶，微生物細胞可以克服NO2-產(chǎn)生的部分負面影響，提高微生物對NO2-的忍耐能力。NO2-可以刺激Nitrosomonaseuropaea細胞中的NH3氧化反應(yīng)。氨限制會導(dǎo)致Nitrosomonaseuropaea細胞喪失AMO活性，但是，細胞的其他功能，如HAO活性保持不變。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第53頁；編輯于星期二\17點28分在轉(zhuǎn)錄、翻譯和后翻譯水平上，氨對AMO活性的調(diào)節(jié)研究表明，利用RT-PCR，可以在相同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中檢測出3種amo

基因的所以產(chǎn)物，這表明amoC

是amo操縱子的一部分。在Nitrosomonaseuropaea

細胞中，amo以及hao的轉(zhuǎn)錄受氨分子的誘導(dǎo)。但是在氨饑餓條件下，這些基因的mRNA在8小時內(nèi)會消失。通過蛋白質(zhì)印跡（westernblot）和酶活性測量等研究表明，在氨饑餓的Nitrosomonaseuropaea

細胞中，HAO可以保持穩(wěn)定長達72小時。在自然界中，即使在氨濃度波動的條件下，氨氧化的2種關(guān)鍵酶，AMO和HAO，仍然可以保持穩(wěn)定。2001-12-8本文檔共69頁；當前第54頁；編輯于星期二\17點28分氨氧化酶的基因

氨單氧合酶基因AMO的3個多肽由3個相鄰的基因amoC，amoA

和amoB編碼（圖1）。在N.europaea

的基因組中，AMO在2個幾乎相同的（>99%）拷貝中。其他的NH3-氧化細菌（如Nitrosomonascryotolerans，Nitrosococcusoceanus，Nitrosospirasp.NpAV）的amo基因與N.europaea的amo基因高度相似。在不同的NH3-氧化細菌中，基因蔟amoCAB出現(xiàn)在3個拷貝中。在生長的N.europaea細胞中可以檢測出AMO的3個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分別對應(yīng)于amoC，amoAB和

amoCAB

。關(guān)于AMOmRNAs的知識目前還不太了解，它們可能來自amoCABmRNA的加工，也可能來自amoC和amoA的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄的起始位點在amoC起始密碼子上游的166和103bp處，以及在amoC和amoA基因間區(qū)中amoA起始密碼子上游114bp處。

2001-12-8本文檔共69頁；當前第55頁；編輯于星期二\17點28分羥胺氧化還原酶基因

編碼羥胺氧化還原酶的基因hao，長度為1710bp，表達為單順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。該基因也編碼18–24氨基酸前導(dǎo)序列，特別是周質(zhì)蛋白質(zhì)，它們在HAO的轉(zhuǎn)運和成熟期間被去除。N.europaea的基因組包含3個分隔的HAO基因拷貝。除了在一個基因拷貝中有1個核苷酸差別外，hao基因3個拷貝的編碼區(qū)域是相同的。2001-12-8本文檔共69頁；當前第56頁；編輯于星期二\17點28分用于氨氧化菌多樣性分析的分子生物學(xué)方法是基于amoA基因（編碼所有氨氧化細菌中氨單加氧酶亞單位的活性位點）和/或16SrRNA基因分析。200余個

amoA基因片斷的比較序列分析結(jié)果顯示，屬于-Proteobacteria的各種氨氧化菌大量存在于廢水處理廠的硝化活性污泥中，除N.europaea,Nitrosomonaseutropha,Nitrosococcusmobilis外，還有Nitrosomonasmarina等。amoA分析結(jié)果表明，與其它生態(tài)系統(tǒng)不一樣，在這些硝化活性污泥中，Nitrosospira屬的氨氧化菌并不重要。這些發(fā)現(xiàn)與氨氧化菌種群組成的定量FISH分析結(jié)果是一致的。2001-12-8本文檔共69頁；當前第57頁；編輯于星期二\17點28分值得注意的是，非生理活性的氨氧化菌也能夠被FISH方法檢測出，因為這些細菌即使在不利的環(huán)境條件下，細胞內(nèi)也會有高含量的核糖體。利用MAR-FISH技術(shù)和14C同位素標記的碳酸氫鹽作底物，可以精確地測定生理活性的氨氧化菌。最近，利用定量PCR技術(shù)和FISH技術(shù)，人們完成了氨氧化菌的分子工具箱。據(jù)此，可以推測出復(fù)雜樣品，包括活性污泥中這些細菌的絕對細胞濃度。這些方法，如果與專一性合適的引物或探針結(jié)合，可以成為非常有價值的工具，用于確定廢水處理廠設(shè)計和運行中的一些重要參數(shù)。2001-12-8本文檔共69頁；當前第58頁；編輯于星期二\17點28分分子生物學(xué)分析結(jié)果表明，在大多數(shù)廢水處理廠中，Nitrospira-類，而不是Nitrobacterspp.，是占優(yōu)勢的亞硝酸氧化菌。最新研究表明，在其它生態(tài)系統(tǒng)，如飲用水配水系統(tǒng)或土壤中，這些Nitrospira-類亞硝酸氧化菌也起著重要作用。2001-12-8本文檔共69頁；當前第59頁；編輯于星期二\17點28分MAR-FISH技術(shù)分析活性污泥中被標記為紅色的Nitrospira-類亞硝酸鹽氧化菌的照片2001-12-8本文檔共69頁；當前第60頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第61頁；編輯于星期二\17點28分2001-12-8本文檔共69頁；當前第62頁；編輯于星期二\17點28分許多水域發(fā)生的水體富營養(yǎng)化使人們對硝化過程的研究越來越深入，氨氧化反應(yīng)是硝化過程的關(guān)鍵步驟。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為氨氧化細菌的研究提供了有力的工具，人們對氨氧化微生物的生物化學(xué)和分子