第二節(jié)食品蛋白質(zhì)及氨基酸

（二）蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

蛋白質(zhì)（protein）是復(fù)雜的含氮化合物，分子量很大，大部分高達(dá)數(shù)萬～數(shù)百萬，它們由20種氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來，并具有一定的空間結(jié)構(gòu)，所含的主要化學(xué)元素為C、H、O、N，在某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等元素。但含氮則是蛋白質(zhì)區(qū)別于其它有機物的主要標(biāo)志。

蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其水解的中間產(chǎn)物為胨、肽等，最終產(chǎn)物為氨基酸。本文檔共26頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\12點13分（三）氨基酸的作用

氨基酸（aminoacids）是合成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20多種，其中有些氨基酸在人體內(nèi)不能合成或合成量不足，必需由食物供應(yīng)，是蛋白質(zhì)生物合成所必需的，又稱為必需氨基酸，這些氨基酸有色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸8種，對于嬰兒還有組氨酸。另一部分氨基酸在體內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成時也是需要的，但能在體內(nèi)合成，不一定由食物供給，稱非必需氨基酸。本文檔共26頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\12點13分二、蛋白質(zhì)的測定

（一）凱氏定氮法

測定蛋白質(zhì)含量的方法很多，國家標(biāo)準(zhǔn)方法為凱氏（Kjeldahl）定氮法，它是測定總有機氮的最準(zhǔn)確和操作較簡便的方法之一。

凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的主要依據(jù)是：各種蛋白質(zhì)均有恒定的含氮量，只要能準(zhǔn)確測定出食物中的含氮量，即可推算出蛋白質(zhì)的含量。

注意：凱氏定氮法所測得的含氮量為食品中的總氮量，其中還包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游離氨氮、生物堿氮、無機鹽氮等。故由定氮法計算所得蛋白質(zhì)的量，稱為粗蛋白質(zhì)（crudeprotein）含量。本文檔共26頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\12點13分乳制品6.38花生5.46肉6.25面粉5.70米5.95大麥、小米5.83玉米、高梁6.24大豆5.71芝麻、向日葵5.30氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)本文檔共26頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\12點13分（1）基本原理

蛋白質(zhì)樣品與硫酸和催化劑（硫酸鉀和硫酸銅）一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化成CO2和H2O逸出，樣品中的有機氮被分解為氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。

最低檢出量為0.05mg氨，相當(dāng)于0.3mg蛋白質(zhì)。

本文檔共26頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\12點13分本文檔共26頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\12點13分（2）操作注意事項

①樣品的消化：

2NH2（CH2）2COOH＋13H2SO4→（NH4）2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O

濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氧；

濃硫酸又具有氧化性，將有機物炭化后的碳、氫氧化為CO2和H2O，硫酸被還原為SO2，SO2使氮還原為氨，氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。

加硫酸鉀－－提高溶液沸點，加快有機物分解。

溶液沸點可從340℃提高至400℃以上。

加硫酸銅－－催化劑，縮短消化時間。此外還可指示消化終點的到達(dá)（Cu2SO4褐色CuSO4藍(lán)綠色）。本文檔共26頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\12點13分②蒸餾：

（NH4）2SO4＋2NaOH2NH3↑＋Na2SO4＋2H2O

蒸餾時樣品中的氨是否蒸完，可用精密pH試紙測試?yán)淠菏欠耧@堿性來確定。也可用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨作回收試驗，確定蒸餾條件，并嚴(yán)格掌握蒸餾時間。

③吸收與滴定：

2NH3＋4H3BO3（NH4）2B4O7＋5H2O

（NH4）2B4O7＋2HCl＋5H2O2NH4Cl＋4H3BO3

使用混合指示劑，目的是使變色敏銳。在堿性溶液中呈綠色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈紅色。本文檔共26頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\12點13分GB\GB5009.5-2010食品中蛋白質(zhì)的測定.pdf本文檔共26頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\12點13分（3）測定樣品的蛋白氮

向樣品中加入三氯乙酸溶液使其最終濃度為5%，然后測定未加入三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸溶液樣品上清液中的含氮量，進(jìn)一步算出蛋白質(zhì)含量：

蛋白氮=總氮－非蛋白氮本文檔共26頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\12點13分（二）水楊酸比色法

樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化轉(zhuǎn)化成銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水楊酸鈉溶液與次氯酸鈉溶液作用生成有顏色的化合物，可在660nm處比色測定，由所求的含氮量，換算成蛋白質(zhì)含量。

（三）福林－酚比色法

是檢測可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。

蛋白質(zhì)與福林（Folin）－酚試劑反應(yīng)后，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。作用機理主要是蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性銅鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，同時也與蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸——磷鎢試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色，呈色強度與蛋白質(zhì)含量成正比。本文檔共26頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\12點13分雙縮脲反應(yīng)：脲素加熱至150-160℃左右，兩分子脲素脫去一分子氨，生成雙縮脲。雙縮脲在堿性條件下能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。本文檔共26頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\12點13分三、氨基酸的組成分析

1、紙上層析分離測定：

2、薄層層析分離測定：

3、紙上電泳分離測定：帶電粒子（膠?；蚍肿樱┰谥绷麟妶鲎饔孟?，能向異性電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。本文檔共26頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\12點13分4、氣相色譜法分離測定：

（1）原理：

將氨基酸通過正丁醇的酯化和三氟醋酸酐（TFAA）的?；?，轉(zhuǎn)變成適合于氣相色譜分析的氨基酸衍生物——三氟乙?；□?，反應(yīng)產(chǎn)物用氣相色譜進(jìn)行測定。

（2）氣相色譜儀：帶程序升溫和氫火焰離子檢測器。

程序升溫：進(jìn)樣后3.5min，以4℃/min程序升溫，從80℃～215℃。本文檔共26頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\12點13分（3）樣品處理：

第一步酯化反應(yīng)：將經(jīng)蛋白質(zhì)水解得到的稀鹽酸（0.1mol/L）氨基酸溶液加入10ml容量瓶中，置于100℃砂浴中，吹入高純氮氣，蒸發(fā)水分。待恰好干燥時取出，加入0.5ml二氯甲烷溶液，再置于砂浴中，繼續(xù)吹入高純氮氣，使殘余的水分和二氯甲烷成共沸物吹出。吹干后，加入鹽酸濃度為3mol/L的鹽酸—正丁醇溶液，在超聲波浴中振蕩2min，以加速氨基酸的溶解（當(dāng)樣品中有堿性氨基酸和胱氨酸等組分時，尤需此步驟，否則氨基酸不能溶解影響酯化反應(yīng)的進(jìn)行）。蓋緊磨口塞，將容量瓶置于100℃砂浴中，酯化35min。

R—CH-NH2—C=O-OH＋C4H9OH

R—CH-NH3+Cl—C=O-OC4H9＋H2O本文檔共26頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\12點13分3+Cl—C=O-OC4H9＋（CF3C=O）2O

R—CH-NH-C=O-CF3—C=O—OC4H9

本文檔共26頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\12點13分5、液相色譜分離測定：

（1）原理：

蛋白質(zhì)樣品經(jīng)酸或堿水解后，再用丹磺酰氯進(jìn)行衍生化作用，用反相液相色譜、C8反相柱，采用熒光檢測器能良好地測定出各種氨基酸的含量。（24種）

（2）液相色譜儀：熒光檢測器，激發(fā)波長298nm，發(fā)射波長546nm。具有10μm粒度C8反相柱和梯度洗脫程序系統(tǒng)。

本文檔共26頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\12點13分（3）樣品處理：

①蛋白質(zhì)的水解：蛋白質(zhì)樣品中加入6mol/LHCl溶液，封口，移入110℃恒溫箱中加熱16-24h，加亮氨酸作為內(nèi)標(biāo)溶液，在水浴中蒸發(fā)干燥。

②衍生物制備及其測定：調(diào)pH為10.5，再加入丹磺酰氯工作試劑，封口，充分振搖15min，再于100℃水浴中加熱2min。加入混合流動相溶液后進(jìn)樣，記錄色譜圖。

③各種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣品處理。本文檔共26頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\12點13分6、氨基酸自動分析儀法分離測定：國標(biāo)法。

不適用于蛋白質(zhì)含量低的水果、蔬菜、飲料和淀粉類食物的氨基酸測定。

（1）原理

食品中的蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，利用各種氨基酸的離子特性、極性和分子量大小等性質(zhì)的不同，使用陽離子交換樹脂進(jìn)行色譜分離，再用不同的pH值和離子濃度的緩沖液依次將它們洗脫，被洗脫下來的氨基酸與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，進(jìn)行定量比色分析。本文檔共26頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\12點13分洗脫的順序為：酸性氨基酸和極性較大的氨基酸，其次是非極性的和芳香性氨基酸，最后是堿性氨基酸。相對分子質(zhì)量小的比相對分子質(zhì)量大的先下來。

（2）蛋白質(zhì)水解

準(zhǔn)確稱取一定量的試樣放入水解管中，在水解管中加入6mol/L鹽酸10-15mL，再將水解管放入冷凍劑中冷凍3-5min，抽真空，充氮氣，重復(fù)三次，在充氮氣狀態(tài)下封口。將水解管放在110℃±1℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。本文檔共26頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\12點13分（3）樣品處理

樣品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、無機鹽等雜質(zhì)時，必須先除去雜質(zhì)后再進(jìn)行酸水解處理。

糖和淀粉、脂肪、核酸、無機鹽等雜質(zhì)的去除法：

①去糖和淀粉：樣品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗滌，得蛋白質(zhì)沉淀物。

②去脂肪：先將干燥的樣品研碎后，用丙酮或乙醚等有機試劑離心或過濾抽提，得蛋白質(zhì)沉淀物。

③去核酸：將樣品置于10%氯化鈉溶液中，于85℃加熱6小時，然后用熱水洗滌，過濾后將固形物用丙酮干燥。

④去無機鹽：樣品經(jīng)水解后含有大量的無機鹽時，必須用陽離子交換樹脂處理—去鹽處理。本文檔共26頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\12點13分（4）樣品分析

把經(jīng)處理后的樣品上柱分析，上柱的樣品量視自動分析儀的靈敏度而定。上機測定用的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度為5.00nmol/50μL。測定必須在pH2.2條件下進(jìn)行，用外標(biāo)法測定試樣中混合氨基酸含量。

注意事項：（1）干