分子生物學(xué)技術(shù)在輸血中的應(yīng)用

分子生物學(xué)技術(shù)在輸血中的應(yīng)用分子生物學(xué)的基本內(nèi)容研究生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)、功能和生物合成等方面來闡明各種生命現(xiàn)象的本質(zhì)。1944年O.T.埃弗里等證明了DNA是遺傳物質(zhì)。1953年J.D.沃森和F.H.C.克里克提出了DNA的反向平行雙螺旋結(jié)構(gòu)。1958年Crick提出的中心法則。1961年法國科學(xué)家F.雅各布和J.莫諾提出了操縱子的概念，解釋了原核基因表達(dá)的調(diào)控。PCR技術(shù)的創(chuàng)建Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想；1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)；

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)；1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。KaryB.Mullis（1944－）PCR打開了基因研究的大門！PCR技術(shù)的發(fā)展引發(fā)了基因研究的熱潮:為測序提供了足夠的模版，基因的多態(tài)性被發(fā)現(xiàn)；GenBank：是美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)維護(hù)的基因序列數(shù)據(jù)庫，匯集并注釋了所有公開的核酸以及蛋白質(zhì)序列。每個(gè)紀(jì)錄代表了一個(gè)單獨(dú)的、連續(xù)的、帶有注釋的DNA或RNA片段；PCR是基礎(chǔ)??！基因組DNA獲取特定DNA片段擴(kuò)增特定DNA片段常用的PCR技術(shù)PCR-SSP：根據(jù)不同血型的基因序列中特異性差別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，有或無？PCR-RFLP:限制性片斷長度多態(tài)性分析；無法分辨雜合子；PCR-SSOP:序列特異性寡核苷酸探針法；PCR-SEQ:產(chǎn)物測序分析。結(jié)果直接，適于發(fā)現(xiàn)新的SNP；RT-PCR：

實(shí)時(shí)PCR。PCR就是包工隊(duì)干一個(gè)工程圖紙——模板DNA；包工頭（現(xiàn)場工程師）——引物；工人——DNA聚合酶；磚頭——dNTP；現(xiàn)場環(huán)境——buffer；工作環(huán)境——變性、退火、延伸的溫度時(shí)間；伙食（營養(yǎng)品）——Mg2+；干多少活？——循環(huán)次數(shù)；驗(yàn)收——觀察結(jié)果。想干好活兒的注意事項(xiàng)圖紙質(zhì)量好——模板DNA質(zhì)量好；☆☆DNA保存時(shí)間:4℃，3～5天；長期保存，-70℃。包工頭（現(xiàn)場工程師）不亂來——引物；☆☆☆工人適合——DNA聚合酶；☆☆干不好換！但是不能多，否則就有亂干的。磚頭夠用——dNTP；☆多重PCR注意！現(xiàn)場環(huán)境適合，工人工頭都喜歡——buffer；☆☆☆不適合就換。工作環(huán)境適合——變性、退火、延伸的溫度時(shí)間；☆☆☆☆伙食（營養(yǎng)品）——Mg2+；☆☆吃多吃少都不行！干多少活？活干多了，就干亂了——循環(huán)次數(shù)；☆☆注意擴(kuò)增效率。驗(yàn)收很重要：判定活兒是否完成，是否符合要求。個(gè)人的體會：凝膠電泳圖很重要，決定要調(diào)整其中的哪些要素？大海航行靠舵手引物是PCR的關(guān)鍵，對于基因擴(kuò)增引物，應(yīng)選擇特異性位點(diǎn)（置），避免同源性高的序列干擾；SSP引物，目的基因有多個(gè)SNP位點(diǎn)，盡量設(shè)置于上下游引物的3’端；如只能有一個(gè)SNP位點(diǎn)可用，另一個(gè)引物應(yīng)避免互補(bǔ)序列和連續(xù)重復(fù)序列；必要的妥協(xié)，把握關(guān)鍵點(diǎn)。SSP—錯(cuò)配耐受PCR-SSP有時(shí)會出現(xiàn)引物特異性不高，更改條件無效或者不穩(wěn)定。常用的PCR方法多重PCR：多個(gè)引物置于同一反應(yīng)管中，可以節(jié)約反應(yīng)資源；難點(diǎn)在于不同的引物退火溫度難以一致；擴(kuò)增效率不一樣；搶奪資源（工人和板磚）；引物間可能的結(jié)合；質(zhì)控品要多。巢式PCR：兩輪PCR，敏感度高，可檢出微量DNA！第一輪的產(chǎn)物是第二輪的模板；對于鑒定某個(gè)特定基因來說，關(guān)鍵點(diǎn)在于第一輪引物一定要有特異性(針對微量DNA)，第二輪引物盡量有特異性。降落PCR：將擴(kuò)增分為3個(gè)階段，退火溫度由高到低——提高特異性；階段1：高退火溫度，引物與目的基因少量結(jié)合擴(kuò)增；非目的基因不結(jié)合；階段2：降低退火溫度，引物與目的基因更多結(jié)合——形成優(yōu)勢模板；非目的基因可能有少量擴(kuò)增；階段3（10～15cycles）：優(yōu)勢模板下擴(kuò)增可以觀察到產(chǎn)物；非目的基因產(chǎn)物少（來不及啦），觀察不到產(chǎn)物。分子生物學(xué)與輸血病毒核酸擴(kuò)增檢測：NAT；血型檢測：紅細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞。抗體的替代；新生兒溶血病檢測：胎兒血型的預(yù)測；血小板細(xì)菌污染檢測；其他。NATNucleicAcidAmplificationTesting縮短“窗口期”的作用：艾滋病病毒縮短至7～11天；乙肝、丙肝病毒由原來的50天、72天縮短到9～25天、59天?；旌稀螜z；聯(lián)檢、單檢。血型與基因血型是以血液抗原形式表現(xiàn)出來的一種遺傳性狀，專指個(gè)體間遺傳標(biāo)志的差異，基礎(chǔ)是基因表達(dá)的多態(tài)性。紅細(xì)胞抗原和基因糖脂質(zhì)：ABH-----基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶；糖蛋白：MNSs------基因編碼的結(jié)合性蛋白；蛋白質(zhì)類抗原：Rh，Kell------基因編碼的蛋白質(zhì)。通常血型的多態(tài)性表現(xiàn)往往與一些突變的基因有關(guān)；基因的突變、重組、調(diào)控因子的改變以及上游底物的變化都會影響血型抗原的形成；基因分型是解決某些特殊血型狀況的手段。ABO血型基因1990年Yamamoto對ABO基因進(jìn)行克隆和測序。現(xiàn)有的ABO基因分型檢測都是以他的研究為基礎(chǔ)；編碼ABO血型糖基轉(zhuǎn)移酶的基因位于人類染色體9q34，共7個(gè)外顯子，不同ABO血型基因主要差異在6、7外顯子上，有數(shù)個(gè)堿基的突變。ABO基因的特點(diǎn)特征性：O，261delG；B，526G；A1基因在增強(qiáng)子區(qū)有一個(gè)43bp的序列，B/O有4個(gè)；…….共同性：A/B/O基因之間有交叉的SNP位點(diǎn)；需要多個(gè)PCR-SSP來確定ABO基因型。商品化的ABO分型試劑ABO基因的檢測策略在日常工作中，ABO血型檢測應(yīng)以血清學(xué)方法為主，基因分型方法的使用應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況按照“分級”的原則來掌握，以達(dá)到針對性強(qiáng)，費(fèi)效比高的目的；分級原則主要內(nèi)容包括：①血清學(xué)檢測結(jié)果明確、無疑義的樣本不作基因分型；②只需明確樣本是否攜有A或B等位基因時(shí)，可采用PCR-SSP方法或第6、7外顯子測序法；③需明確區(qū)分ABO等位基因具體型別時(shí)，需采用基因測序法。測序范圍包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、第1～7外顯子以及部分內(nèi)含子的序列。必要時(shí)可克隆測序，以明確鑒定ABO基因型以及基因突變位點(diǎn)。ABO基因的測序分析擴(kuò)增第6、7外顯子并測序：測序時(shí)可先對第6外顯子進(jìn)行測序，以確定樣本是否為含有O隱性等位基因的雜合子。然后再對第7外顯子進(jìn)行測序。確定是否攜有A或B基因：測序時(shí)可先對第6外顯子進(jìn)行測序，以確定樣本是否為含有O隱性等位基因的雜合子。然后再對第7外顯子進(jìn)行測序。261delG，由于G的缺失致測序圖出現(xiàn)錯(cuò)位峰，說明有一條O基因，可初步鑒定出樣本為O型或非O型。樣本2：正定型抗-A可疑，抗-B強(qiáng)陽性，反定型為B型樣本，ABO基因第6外顯子進(jìn)行測序分析：第6外顯子存在261delG和297A/G套峰。雖然297A/G套峰可在B/O基因型中出現(xiàn)（B基因該位點(diǎn)為G，A101和O01基因型該位點(diǎn)為A），也可在A/O基因型中出現(xiàn)（O02/O03等一些非O01型，該位點(diǎn)也為G），但261delG明確表明該基因存在O等位基因，結(jié)合正定型B抗原為強(qiáng)陽性的血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，判定該樣本基因型應(yīng)為B/O型。

案例：母親O型，父親B型，孩子為A型？？親子鑒定結(jié)果為孩子與父親是親生關(guān)系。血清學(xué)結(jié)果：母親正定O，反定與A/B/O細(xì)胞凝集，H抗原陰性——孟買型；ABO基因分析結(jié)果：母親為A/O型。ABO基因測序基因測序面臨的難題是如何確定突變位點(diǎn)究竟位于那個(gè)等位基因，這也是ABO基因分型研究的難點(diǎn)；可采用第6、7外顯子克隆測序的方法。通過克隆測序可確定堿基突變是位于A基因、B基因還是O基因；根據(jù)某一突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增ABO基因第6、7外顯子的單鏈后再進(jìn)行測序，明確一條單鏈上雜合峰位置的堿基，即可判斷出另一條鏈上的堿基。單鏈測序：根據(jù)已知的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增，測序。分析是在雙鏈測序的基礎(chǔ)上—雙鏈測序來發(fā)現(xiàn)套疊峰（突變位點(diǎn)），單鏈測序來判斷在哪一條等位基因上。1例弱A表現(xiàn)型進(jìn)行基因測序分析，發(fā)現(xiàn)第6外顯子從261位開始連續(xù)出現(xiàn)錯(cuò)位峰，提示該樣本為A/O雜合子。第7外顯子第421位出現(xiàn)了T/C套疊峰。經(jīng)單鏈鑒定后，確定為一個(gè)新的A糖基轉(zhuǎn)移酶等位基因（Genbank，JN851703）。

RHD基因顯性基因，孟德爾遺傳規(guī)律；Rh陰性：RHD基因缺失；RHD-RHCE融合喪失RHD特性，RHD堿基突變和缺失……RHD基因分型方案RHD基因篩查方法M：Marker，Takara，DL2000。1、2為INNO-TRAIN公司的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控對照，1為D/d型，2為d/d型，3～8為待測樣本，3為D/D，4為D/d，5為del/d，6為d/d，7為del/d，8為d/d。RHD新基因RHD

78delC，GenBank：GQ477180；RHD新基因RHD1080del10/d

，GenBank：GU362076；血型基因分型的其它應(yīng)用部分替代血型抗體：部分血型抗體制備困難；價(jià)格昂貴；只有人源抗體；抗體稀有。輸血反應(yīng)樣本的血型鑒定。案例：患者直抗1+s，自身1+s，抗篩2+；詢問輸血史：40天前輸入2U紅細(xì)胞；抗體鑒定：抗-Jka特異性；患者Duffy抗原：Jka(1+)；Jkb(3+)；基因分型結(jié)果：患者Jka基因陰性。Jka抗原為輸入性。對照內(nèi)對照：證明反應(yīng)孔擴(kuò)增成功，以目的基因的共同片段設(shè)計(jì)為佳；樣本對照：證明特異性。陽性對照的制備陽性基因；定點(diǎn)突變：通過PCR向目的DNA片段中引入所需變化，包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等；克隆。血小板細(xì)菌污染檢測血小板制品的儲存溫度為22±2℃，適合細(xì)菌生長和繁殖，在采集過程中因穿刺有可能污染的細(xì)菌；據(jù)US-FDA統(tǒng)計(jì)，血小板制品被細(xì)菌污染率為1/1000-1/3000；保證輸注血小板制品的安全性：病原微生物滅活技術(shù)；快速檢測細(xì)菌污染。血小板制品檢測的方法要求是敏感、特異、所需時(shí)間短和所需的樣本量少；目前常用的檢測方法有四類：1.常規(guī)的培養(yǎng)方法；2.核酸檢測；3.應(yīng)用流式