蛋白質(zhì)核酸沉淀分離技術(shù)

蛋白質(zhì)核酸沉淀分離技術(shù)第一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五沉淀和結(jié)晶的區(qū)別:形態(tài)成分純度結(jié)晶:同類分子或離子以規(guī)則排列形式析出；沉淀:無(wú)序析出，純度遠(yuǎn)低于結(jié)晶。操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小時(shí)，常采用間歇法。第二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條件的因素都會(huì)破壞溶液的穩(wěn)定性。沉淀法就是采用適當(dāng)?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液的各種成分的溶解度，從而將溶液中的欲提取的成分和其它成分分開(kāi)的技術(shù)。第三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五沉淀法操作步驟：①加入沉淀劑。②沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長(zhǎng)；③離心或過(guò)濾，收集沉淀物。加沉淀劑的方式和陳化條件對(duì)產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響。第四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五沉淀能否發(fā)生；沉淀劑或沉淀?xiàng)l件下對(duì)活性結(jié)構(gòu)是否有破壞作用；沉淀劑是否容易除去；用于食品、醫(yī)藥產(chǎn)品的沉淀劑是否對(duì)人體有害。

沉淀過(guò)程應(yīng)考慮的問(wèn)題：第五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五沉淀技術(shù)分離生化產(chǎn)物的典型例子是蛋白質(zhì)的分離提取

優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、原材料易得、便于小批量生產(chǎn)；

缺點(diǎn)：所得沉淀物可能聚集有多種物質(zhì)，或含有大量的鹽類，或包裹著溶劑，產(chǎn)品純度常比結(jié)晶法低，過(guò)濾也較困難。第六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五e(cuò)g.從血漿中通過(guò)5步沉淀生產(chǎn)純度高達(dá)99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。圖1利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純白蛋白與免疫球蛋白的工藝流程圖第七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五沉淀法分離蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：生產(chǎn)前期可使原料液體體積很快減小10~50倍，從而簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費(fèi)用；使中間產(chǎn)物保持在一個(gè)中性溫和的環(huán)境；可及早將目標(biāo)蛋白從其與蛋白水解酶混合液中分離出來(lái)，避免蛋白質(zhì)的降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；用蛋白質(zhì)沉淀法作為色譜分離的前處理技術(shù)，可使色譜分離使用的限制因素降低到最少。第八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五§3.2蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)的溶解行為是一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)象以及分子周圍的環(huán)境所決定。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解。第九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五圖2蛋白質(zhì)分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域第十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)性質(zhì)溶液性質(zhì)分子大小溶劑可利用度（如：水）氨基酸組成pH值氨基酸序列離子強(qiáng)度可離子化的殘基數(shù)溫度極性/非極性殘基比率極性/非極性殘基分布氨基酸殘基的化學(xué)性質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)電性化學(xué)鍵性質(zhì)表1影響蛋白質(zhì)溶解度的參數(shù)第十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五§3.3蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障：⑴蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydrationshell)可以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。⑵蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）因此，可通過(guò)降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層厚度（ζ電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。第十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五吸引力顆粒間的相互作用顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。VanderWaals力Keeson引力（偶極力）Debye引力（誘導(dǎo)力）London引力（色散力）是最重要的一種引力，因?yàn)樗蟹肿佣际强梢员粯O化的，所以它是普遍存在的。第十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五其他沉淀法金屬沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法非離子型聚合物沉淀法§3.4蛋白質(zhì)沉淀方法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法中性鹽鹽析法第十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備②操作簡(jiǎn)單、安全③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用一、中性鹽沉淀法（鹽析法）鹽析：在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過(guò)程。得到的樣品欲繼續(xù)純化，需花一定時(shí)間脫鹽。優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鹽濃度Salting-in溶解度Salting-out第十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2和－OH等親水基團(tuán)，與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。1、中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理親水膠體在水中的穩(wěn)定因素電荷水化膜第十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五++++++++++++++++等點(diǎn)電時(shí)的蛋白質(zhì)（親水膠體）帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）脫水脫水脫水帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽(yáng)離子堿酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）堿++水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）第十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五由于中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水化膜，暴露出疏水區(qū)域。同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。第十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五選用鹽析用鹽的幾點(diǎn)考慮： 鹽析作用要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來(lái)源豐富、經(jīng)濟(jì)2、中性鹽的選擇第十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五陰離子：

檸檬酸根-3>酒石酸根-3>F->I03->H2P04->S04->CH3C00->Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS-陽(yáng)離子：

Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+Hofmeister對(duì)一系列離子沉淀蛋白質(zhì)的能力進(jìn)行排序，稱Hofmeister序列，或感膠離子序。第二十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五常用于蛋白質(zhì)沉淀的鹽為硫酸銨和硫酸鈉。硫酸鈉雖無(wú)腐蝕性但低于400C就不易溶解，因此只適用于熱穩(wěn)定性較好的蛋白質(zhì)的沉淀過(guò)程。0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101第二十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）溶解度大（2）分離效果好（3）不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。（4）價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。最常用的鹽：硫酸銨緩沖能力弱，具腐蝕性，含N缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)第二十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）加入固體鹽法3、鹽析的操作方法適用：飽和度高，不增大溶液體積加入硫酸銨固體的量：查表、計(jì)算查表時(shí)注意溫度飽和度：在給定條件下以可能達(dá)到的最大濃度的百分?jǐn)?shù)表示的鹽濃度。第二十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）加入固體鹽法20℃25℃g：加入固體硫酸銨的質(zhì)量S2：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度S1：原溶液的硫酸銨飽和度

第二十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）加入飽和溶液法適用：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高。V：所需加進(jìn)的飽和硫酸銨溶液的體積；V0：原溶液體積；S2：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度；S1：原溶液的硫酸銨飽和度。飽和硫酸銨的配制方法在一定量的水中加入過(guò)量的硫酸銨，加熱至50－60℃，趁熱濾去沉淀，再在0℃或室溫平衡1－2天，有固體析出時(shí)達(dá)100％飽和度。第二十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五優(yōu)點(diǎn)硫酸銨濃度變化連續(xù)，鹽析效果較好。缺點(diǎn)硫酸銨飽和度的測(cè)定、計(jì)算工作手續(xù)繁瑣，而且透析袋容積有限、鹽析速度慢、硫酸銨耗費(fèi)大。（3）透析平衡法第二十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五方法一：取料液分成等體積幾份，冷卻至0℃4、鹽析曲線的制作各級(jí)均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2倍體積的緩沖液中，測(cè)定其中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度（或測(cè)定離心上清液）以飽和度為橫坐標(biāo)，沉淀（或上清液）中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度為縱坐標(biāo)，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線第二十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％第三十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五方法二各級(jí)均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2倍體積的緩沖液中，測(cè)定其中總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度以飽和度為橫坐標(biāo)，總蛋白和目標(biāo)蛋白濃度為縱坐標(biāo)，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線第三十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％第三十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五5、鹽析的影響因素（1）離子強(qiáng)度與離子類型S：離子強(qiáng)度為I時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度；S0：離子強(qiáng)度為0時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度；KS：鹽析常數(shù)。鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度與中性鹽的離子強(qiáng)度的關(guān)系：當(dāng)溶劑的溫度一定時(shí)，對(duì)于某一溶質(zhì)，S0是一常數(shù)β（溶解度常數(shù)）第三十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五KS越大，有效成分溶解度隨鹽濃度增加而減小的程度越大。KS越大，分級(jí)范圍越小，鹽析效果越好。多價(jià)陰離子具有很高的KS，但高價(jià)陽(yáng)離子的存在反而降低KS；大而不規(guī)則的蛋白分子KS越大。KS主要取決于鹽的性質(zhì)：離子價(jià)數(shù)離子半徑介電常數(shù)KS幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂第三十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五1——纖維蛋白2——血紅蛋白3——擬球蛋白4——血清蛋白5——肌紅蛋白幾種蛋白鹽析時(shí)離子強(qiáng)度與溶解度的關(guān)系圖第三十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五KS分段鹽析法Β分段鹽析法在一定pH、溫度條件下，改變離子強(qiáng)度。適用于早期粗提階段的分步分離。在一定離子強(qiáng)度下，改變pH、溫度。適于后期分離純化和精制。第三十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）蛋白質(zhì)濃度硫酸銨鹽析法測(cè)定羧基肌紅蛋白：蛋白質(zhì)濃度g/L硫酸銨飽和度%結(jié)果3058開(kāi)始沉淀366開(kāi)始沉淀306590%沉淀析出當(dāng)?shù)鞍诐舛仍黾?0倍時(shí)，鹽析時(shí)所需硫酸銨的飽和度約減小7%。適宜蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％（25mg/mL～30mg/mL）第三十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五（3）pH的影響蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。改變pH值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，因而就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)處溶解度大，在等電點(diǎn)處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。在水或稀鹽溶液中測(cè)得的等電點(diǎn)與在高鹽溶液中測(cè)得的等電點(diǎn)結(jié)果可能不一樣注意第三十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五（4）溫度的影響溫度是影響溶解度的重要因素，對(duì)于多數(shù)無(wú)機(jī)鹽和小分子有機(jī)物，溫度升高溶解度加大。但對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的。

在一般情況下，對(duì)蛋白質(zhì)鹽析的溫度要求不嚴(yán)格，可在室溫下進(jìn)行。但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。

第三十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五1）注意飽和度表中規(guī)定的溫度；2）分段鹽析中，應(yīng)考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化；3）鹽析后一般放置半小時(shí)至一小時(shí)，待沉淀完全后才過(guò)濾或離心；4）加入硫酸銨時(shí)應(yīng)注意攪拌，避免局部過(guò)濃；5）硫酸銨使用前須用H2S處理，高濃度的硫酸銨溶液使用前需用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需pH。

6、注意事項(xiàng)第四十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀法是基于不同蛋白質(zhì)離子具有不同等電點(diǎn)這一特性，依次改變?nèi)芤簆H值的辦法，將雜蛋白沉淀除去，最后獲得目標(biāo)產(chǎn)物。二、等電點(diǎn)沉淀法第四十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）適用于疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)（2）中性鹽濃度增大時(shí)，等電點(diǎn)向偏酸方向移動(dòng)，同時(shí)最低溶解度會(huì)有所增大。（3）無(wú)機(jī)酸通常價(jià)格便宜，無(wú)毒（4）蛋白質(zhì)對(duì)低pH敏感，易失活第四十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五未沉淀蛋白質(zhì)的分率pH對(duì)大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響第四十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五利用等電點(diǎn)除雜蛋白時(shí)必須了解制備物對(duì)酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險(xiǎn)。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時(shí)，必須注意調(diào)整PH值。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，效果不理想。主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白第四十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五例如：工業(yè)上生產(chǎn)胰島素粗提液調(diào)PH8.0調(diào)PH3.0去除堿性蛋白質(zhì)去除酸性蛋白質(zhì)胰島素第四十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、有機(jī)溶劑沉淀法許多能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)。第四十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五加入溶劑后會(huì)使水溶液的介電常數(shù)降低，而使蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，導(dǎo)致凝集和沉淀。蛋白質(zhì)的溶劑化，使原來(lái)和蛋白質(zhì)結(jié)合的水被溶劑所取代，從而降低了它們的溶解度。有機(jī)溶劑可能破壞了蛋白質(zhì)的某種鍵如氫鍵，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某種程度的變化，致使一些原來(lái)包在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于表面并與有機(jī)溶劑的疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層，從而使蛋白質(zhì)沉淀。機(jī)理分析進(jìn)展第四十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。成本高。優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀不用脫鹽，過(guò)濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）。第四十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算不同有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效率受多方面的影響，需通過(guò)試驗(yàn)加以選擇。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。

前提：能與水互溶V=需加入100％濃度有機(jī)溶劑的體積V0=原溶液體積S1=原溶液中有機(jī)溶劑的濃度S2=所要求達(dá)到的有機(jī)溶劑的濃度第四十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五離子強(qiáng)度3、有機(jī)溶劑沉淀的影響因素溫度樣品濃度pH值有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)必須緩慢且不斷攪拌以免局部過(guò)濃通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，等電點(diǎn)附近通常溶液中鹽濃度以不超過(guò)5％為宜第五十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五四、非離子多聚物沉淀法20世紀(jì)60年代非離子型聚合物開(kāi)始用于分離血纖維蛋白原和免疫球蛋白，從此高相對(duì)分子質(zhì)量非離子聚合物沉淀蛋白質(zhì)的方法被廣泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。第五十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五①沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。②由于聚合物有較強(qiáng)的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀。③聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復(fù)合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通過(guò)空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。非離子多聚物沉淀蛋白的原理第五十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物較難去除。特點(diǎn)：第五十三頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五1）選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離。2）選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。方法第五十四頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五聚電解質(zhì)是含有重復(fù)離子化基團(tuán)的水溶性聚合物，可用于蛋白質(zhì)沉淀的聚電解質(zhì)有聚丙烯酸、聚乙烯亞胺、羧甲基纖維素和離子型多糖如肝素等。沉淀機(jī)理五、聚電解質(zhì)沉淀法蛋白質(zhì)分子的相反電荷與聚電解質(zhì)結(jié)合，形成一個(gè)多分子絡(luò)合物，當(dāng)絡(luò)合物超過(guò)游離蛋白質(zhì)的溶解度極限值時(shí)，就發(fā)生沉淀。第五十五頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五六、生成鹽復(fù)合物沉淀法金屬?gòu)?fù)合鹽法有機(jī)鹽法無(wú)機(jī)復(fù)合鹽法第五十六頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強(qiáng)烈結(jié)合的金屬離子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的金屬離子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；與巰基化合物強(qiáng)烈結(jié)合的金屬離子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。金屬離子沉淀蛋白質(zhì)可分為三類：實(shí)際使用時(shí)，金屬離子的濃度常為0.02mol/L。第五十七頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五Zn2+沉淀尿激酶第五十八頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五有機(jī)鹽法無(wú)機(jī)復(fù)合鹽法含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去有機(jī)酸。如細(xì)胞色素C用45%硫酸銨除雜后，用20%TCA即可將其沉淀。如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等?？杉尤胍颐鸦虿捎秒x子交換除去無(wú)機(jī)鹽。第五十九頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五七、其他沉淀法1、選擇性變性法酸堿變性熱變性表面活性劑變性有機(jī)溶劑變性選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來(lái)，而與目的物分開(kāi)，這種分離方法就稱為選擇性變性沉淀法。第六十頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、親和沉淀利用蛋白質(zhì)與特定的生物或合成的分子之間高度專一的作用而設(shè)計(jì)出來(lái)的一種特殊選擇性的分離技術(shù)，其沉淀原理是依據(jù)“吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小。原理引導(dǎo)產(chǎn)生沉淀的方法有：離子交聯(lián)加入帶相反電荷的聚合物加入帶相反電荷的疏水基團(tuán)改變pH值，誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水沉淀溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀第六十一頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五配基-載體復(fù)合物與目的蛋白質(zhì)的分離基本過(guò)程：親和結(jié)合洗滌初始階段：將一個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體上的親和配體絡(luò)合成沉淀；所得沉淀物用一種適當(dāng)?shù)木彌_溶液進(jìn)行洗滌，洗去可能存在的雜質(zhì)用一種適當(dāng)?shù)脑噭⒛繕?biāo)蛋白質(zhì)從配體中離解出來(lái)第六十二頁(yè)，共七十一頁(yè)，編輯于2023年，星期五§3.4核酸的沉淀方法核酸分離純化應(yīng)維持在0-4℃的低溫條件下，以防止核酸的變性和