第四章反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)演示文稿

第四章反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)演示文稿本文檔共73頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期六\13點2分第四章反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)本文檔共73頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期六\13點2分一、概述（一）遺傳研究的二條途徑1、表→里：正向遺傳學(xué)研究雜交或誘變→表型觀察→遺傳規(guī)律→確定存在的基因及數(shù)目→基因的功能及作用性質(zhì)。這一途徑是從生物體的性狀、表型變化來研究遺傳物質(zhì)的組成、分布與傳遞規(guī)律，屬于正向遺傳學(xué)采用的研究方法。本文檔共73頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期六\13點2分2、里→表：反向遺傳學(xué)研究在已知DNA序列的基礎(chǔ)上，通過DNA重組、定點突變、插入/缺失等遺傳修飾手段創(chuàng)造突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng)，從而研究基因的生物學(xué)功能，闡明生命的本質(zhì)現(xiàn)象與規(guī)律。與反向遺傳學(xué)相關(guān)的遺傳操作技術(shù)為反向遺傳學(xué)技術(shù)。本文檔共73頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期六\13點2分（二）RNA病毒的反向遺傳學(xué)采用病毒的遺傳材料，在培養(yǎng)細(xì)胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或類似病毒物質(zhì)。

能夠拯救病毒的遺傳材料稱為感染性克隆，一般是在細(xì)菌質(zhì)粒中含有整個病毒基因組的cDNA拷貝，使得cDNA本身或從cDNA體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)通過定向修飾病毒的基因組序列，檢測被拯救的人工改造病毒的表型，可以在體內(nèi)(invivo)有效地研究病毒基因結(jié)構(gòu)、功能和病毒-宿主相互作用。

本文檔共73頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期六\13點2分RNA病毒的反向遺傳操作RT-PCR構(gòu)建RNA病毒的全長cDNA，并進(jìn)行遺傳修飾↓與RNA聚合酶啟動子結(jié)合體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA↓轉(zhuǎn)錄物RNA感染哺乳動物細(xì)胞↓拯救到活病毒↓拯救病毒的表型變化

↓病毒基因組的表達(dá)、調(diào)控、致病機理、病毒與宿主細(xì)胞互作、疫苗制造等本文檔共73頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期六\13點2分單正股RNA病毒：RNA聚合酶+mRNA–

++–+中間型

結(jié)構(gòu)蛋白+子代正股RNA單負(fù)股RNA病毒：RNA聚合酶–

+結(jié)構(gòu)蛋白–子代負(fù)股RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒：＋＋RNARNA/DNA中間體逆轉(zhuǎn)錄酶DNA/DNA宿主＋＋子代RNA正股RNA與負(fù)股RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒?本文檔共73頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期六\13點2分（三）真核生物的反向遺傳學(xué)采用反向遺傳學(xué)鑒定基因功能是真核生物功能基因組學(xué)的主要內(nèi)容。研究手段包括基因的互補實驗、超表達(dá)、反義抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。利用基因敲除或基因沉默而產(chǎn)生的功能變化研究基因功能是主要的反向遺傳學(xué)技術(shù)。本文檔共73頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期六\13點2分二、反向遺傳學(xué)相關(guān)技術(shù)1、基因的同源重組2、基因的位點突變3、基因沉默基因敲除本文檔共73頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期六\13點2分利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過載體與靶細(xì)胞染色體上同源序列間的重組，將外源基因整合入內(nèi)源基因組內(nèi)，使外源基因得以表達(dá)。通過研究靶細(xì)胞或者個體在目的基因插入前后遺傳特性的改變，達(dá)到研究基因功能的目的。1、基因的同源重組本文檔共73頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期六\13點2分完全敲除：通過同源重組直接將靶基因在細(xì)胞或者動物個體中的活性完全消除。條件敲除：將某個基因的修飾限制于特定類型的細(xì)胞或個體發(fā)育特定的階段。完全敲除→條件敲除→特定組織/時間基因敲除基因敲除本文檔共73頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期六\13點2分1）通過同源重組的基因敲除步驟構(gòu)建重組載體↓重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)↓篩選目的細(xì)胞↓轉(zhuǎn)基因生物重組載體的類型：a)替換性載體系統(tǒng)：包括同源序列片段、替換基因的啟動子、報道基因等成分。b)插入性載體系統(tǒng)：插入基因片段(目的基因)、同源序列片段、標(biāo)志基因片段。本文檔共73頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期六\13點2分用替換型（a）或插入型（b）載體進(jìn)行完全基因敲除實驗本文檔共73頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期六\13點2分2）Res同源重組系統(tǒng)——源于λ噬菌體Res重組酶的重組系統(tǒng)Ha和Hb:同源重組區(qū)域Pa和Pb:引物位點sm:篩選標(biāo)記

Red同源重組技術(shù)用于基因打靶本文檔共73頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期六\13點2分3）Cre-LoxP同源重組系統(tǒng)——源自P1噬菌體的重組系統(tǒng)屬于傳統(tǒng)的同源重組載體，但具有時空調(diào)控的功能。該系統(tǒng)由P1噬菌體的Cre重組酶和LoxP位點兩部分組成。Cre重組酶：由Cre基因編碼，識別LoxP位點，介導(dǎo)兩個LoxP位點（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。LoxP位點：由2個13bp的反向重復(fù)序列和1個8bp的間隔區(qū)域構(gòu)成。本文檔共73頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期六\13點2分Cre酶Cre酶

Cre酶Cre重組酶13bp的反向重復(fù)序列

本文檔共73頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期六\13點2分Cre-LoxP重組系統(tǒng)的特點CreCreCre重組酶所催化的是一個可逆的重組事件Cre催化重組不需要任何輔助因子的參與介導(dǎo)兩個同向LoxP位點之間序列的插入/缺失（下左）介導(dǎo)兩個反向LoxP位點之間序列顛倒（下右）介導(dǎo)兩條含LoxP位點DNA鏈的交換或染色體易位。

本文檔共73頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期六\13點2分Cre-Loxpgeneknock-outsystem本文檔共73頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期六\13點2分4)高等動物基因敲除技術(shù)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。本文檔共73頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期六\13點2分模式動物小鼠中完全基因敲除的步聚近交系，白色，易產(chǎn)生免疫缺陷

本文檔共73頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期六\13點2分2、基因的位點突變1）點突變—TILLING技術(shù)TILLING(targetinginducedlocallesionsingenomes)—定向誘導(dǎo)基因組局部突變，是一種快速有效地從由化學(xué)誘變劑(EMS)誘變過的突變?nèi)后w中鑒定出點突變的方法。

先用化學(xué)誘變劑(甲基磺酸乙酯，EMS)誘發(fā)產(chǎn)生一系列的點突變，再用設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR擴增，然后將PCR擴增產(chǎn)物變性和退火形成異源雙鏈核酸分子，再用特異切割錯配的內(nèi)切酶CELl酶切，最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測分析。本文檔共73頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期六\13點2分（建池）本文檔共73頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期六\13點2分本文檔共73頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期六\13點2分TILLING特點：TILLING技術(shù)屬于高頻率點突變和PCR篩選相結(jié)合的技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)基因的錯義突變、基因截短型損傷等突變類型?？色@得大量的等位基因系列，對長度很小基因，復(fù)等位基因等具有獨特的技術(shù)優(yōu)勢?？烧T導(dǎo)產(chǎn)生高頻率的點突變，篩選目的基因需要較小的突變?nèi)后w。不依賴于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標(biāo)簽系統(tǒng)，無需耗時的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)。需要知道所研究基因的序列。本文檔共73頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期六\13點2分2）隨機插入突變T-DNA插入突變

以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的一種插入突變研究方法，根據(jù)插入位點的基因序列與植物表型變異等的相互關(guān)系可以從基因組中分離出相應(yīng)的基因并鑒定其功能。構(gòu)建T-DNA載體→轉(zhuǎn)化→突變體的篩選及遺傳分析→分離T-DNA插入位點的側(cè)翼序列→基因的定位、結(jié)構(gòu)與功能分析。本文檔共73頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期六\13點2分T-DNA法敲除植物基因及突變體篩選：a.引物設(shè)計。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物，LB是指載體上的一段引物。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的DNA序列。b.PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。本文檔共73頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期六\13點2分T-DNA插入特點：不能控制其在生物體基因組中的插入位點。在植物中用T-DNA插入來敲除一個特定基因仍需要運氣。隱性突變與顯性突變：隱性——表型的變化只能在轉(zhuǎn)化體的部分后代中體現(xiàn)出來（基因敲除）；顯性——可以在轉(zhuǎn)化體中直接觀察到（基因激活）。某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不體現(xiàn)出功能的喪失。原因：重要的功能基因突變致死和冗余基因。染色體重排：突變體表型與T-DNA插入無關(guān)。效率不高，工作量大。建立飽和的突變體庫。本文檔共73頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期六\13點2分轉(zhuǎn)座子插入突變利用某些能隨機插入基因序列的轉(zhuǎn)座子，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。由轉(zhuǎn)座子引起的突變可以轉(zhuǎn)座子DNA為探針，從突變體的基因組DNA文庫中篩選到突變的基因，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。也可以利用PCR的方法擴增轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，進(jìn)而得到完整的基因信息。本文檔共73頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期六\13點2分轉(zhuǎn)座子插入特點：插入的是完整的元件，便于分析?？蓮牟迦胛稽c切除，產(chǎn)生回復(fù)突變，因此不僅可以據(jù)此確認(rèn)真正由轉(zhuǎn)座子引起的突變，還可以進(jìn)一步驗證突變基因的功能。轉(zhuǎn)座子傾向于插入轉(zhuǎn)座子的臨近區(qū)域，可以用來研究基因組某一局部區(qū)域的結(jié)構(gòu)。通過不斷跳動產(chǎn)生新的突變，相對較少的起始轉(zhuǎn)化系就可以獲得整個基因組的飽和突變，大大減少了工作量?？梢詰?yīng)用于轉(zhuǎn)化效率不高的植物。本文檔共73頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期六\13點2分轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)Ac/Ds系統(tǒng)由自主性元件（Ac）和非自主性元件（Ds）構(gòu)成。Ds元件能夠在Ac編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下移動，去除Ac元件可使其自身不能轉(zhuǎn)座。通過遺傳雜交引入自主性元件，轉(zhuǎn)座子插入序列可以重新移動。因此，Ac/Ds轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)只需要少量的轉(zhuǎn)基因品系（啟動品系）作為轉(zhuǎn)座源即可。本文檔共73頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期六\13點2分在真核系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)座插入事件常不能產(chǎn)生可見的表型，這是因為功能基因的冗余或在早期產(chǎn)生致死效應(yīng)。采用經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)座子可克服這些困難。修飾：轉(zhuǎn)座因子后帶一個報告基因，報告基因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的情況下才能獲得，這樣就可以通過報告基因來檢測轉(zhuǎn)座子的表達(dá)情況。修飾的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)本文檔共73頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期六\13點2分增強子陷阱(enhancertrap)：轉(zhuǎn)座子含有一個具弱小啟動子驅(qū)動的報告基因。報告基因的表達(dá)只有在轉(zhuǎn)座發(fā)生在內(nèi)源增強子附近時才能獲得。啟動子陷阱(promotertrap)：轉(zhuǎn)座子帶有一個無啟動子的報告基因，這個基因只有在轉(zhuǎn)座子插入一個植物活躍的內(nèi)源啟動子下游時才能表達(dá)。修飾的方法-增強子陷阱與啟動子陷阱本文檔共73頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期六\13點2分Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子打靶載體是以兩種噬菌體Mu為基礎(chǔ)的mini-Mu轉(zhuǎn)座子，每個轉(zhuǎn)座子上都攜帶標(biāo)記基因?？梢栽跀M刪除基因兩側(cè)各插入一個mini-Mu轉(zhuǎn)座子，然后在兩個插入位點之間制造缺失。這種缺失可以使兩個轉(zhuǎn)座子加上靶區(qū)之間的部分基因轉(zhuǎn)移。特點：不需要知道基因組序列，僅已知外顯子即可載體構(gòu)建迅速，技術(shù)簡單載體可以攜帶多種不同抗性基因，可以同時處理多基因。本文檔共73頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期六\13點2分三、基因沉默技術(shù)反義RNARNA干擾（RNAi）本文檔共73頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期六\13點2分反義RNA技術(shù)反義RNA技術(shù)是根據(jù)RNA序列人工合成的互補RNA。根據(jù)反義RNA的作用機制可將其分為三類：1、反義RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點或與靶mRNA直接結(jié)合形成雙鏈RNA，從而直接抑制mRNA的翻譯或被RNA酶Ⅲ識別降解。2、反義RNA是與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象的變化，從而抑制其翻譯。3、反義RNA是作用于基因的啟動子，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。本文檔共73頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期六\13點2分（一）概念RNA干擾(RNAinterference，RNAi)：與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾本文檔共73頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期六\13點2分基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)基因沉默本文檔共73頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期六\13點2分轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGS）是指基因在細(xì)胞核內(nèi)RNA合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。轉(zhuǎn)錄水平基因沉默可以通過有性世代傳遞，表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的機制主要有以下幾種：基因及其啟動子甲基化：通常發(fā)生在DNA的CG序列的堿基上，該區(qū)域堿基甲基化往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受抑制。

同源基因間的反式失活：擁有同源序列的沉默位點和其他位點的DNA的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的基因能作為一種“沉默子”，對其他具有同源性的靶基因施加一種反式作用，使具有同源序列的靶基因發(fā)生甲基化并導(dǎo)致失活。反式失活的靶基因既可以與沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。

本文檔共73頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期六\13點2分后成修飾作用導(dǎo)致的基因沉默：指轉(zhuǎn)基因的序列和堿基組成不發(fā)生改變，但是其功能卻在個體發(fā)育的某一階段受到細(xì)胞內(nèi)因子的修飾作用后而關(guān)閉。這種修飾作用所造成的轉(zhuǎn)基因沉默是可以隨著修飾作用的解除而被消除。后成修飾作用導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默與受體植物的核型構(gòu)成有關(guān)。重復(fù)序列：外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位點上，形成首尾相連的正向重復(fù)或頭對頭、尾對尾的反向重復(fù)，則不能表達(dá)，而且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴(yán)重。這種重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默可能是重復(fù)序列間自發(fā)配對，甲基化酶特異性識別這種配對結(jié)構(gòu)而使其甲基化，從而抑制其表達(dá)。本文檔共73頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期六\13點2分轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默（PTGS）則是指基因能夠在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNA存在的現(xiàn)象。引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制主要有以下幾種：共抑制：由Napoli在轉(zhuǎn)CHS基因的矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)，普遍存在于轉(zhuǎn)基因植物中。其發(fā)生是由于外源基因編碼區(qū)與受體細(xì)胞基因間存在同源性而導(dǎo)致外源基因與內(nèi)源基因的表達(dá)同時受到抑制。

具有同源性的外基因和內(nèi)源基因在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄速率很高，但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無mRNA積累，是典型的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。共抑制的產(chǎn)生不僅同內(nèi)、外源基因間編碼區(qū)的同源性有關(guān)，還與控制外源基因的啟動子的強度等因素有關(guān)。本文檔共73頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期六\13點2分基因壓制：Cogoni等首先在粗糙脈孢霉的轉(zhuǎn)化實驗中發(fā)現(xiàn)，外源基因可以抑制自身和相應(yīng)內(nèi)源基因的表達(dá)，他們把這一現(xiàn)象定為基因壓制?；驂褐剖强赡娴?，而且這種逆轉(zhuǎn)會伴隨有外源拷貝的丟失?；驂褐瓢l(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，導(dǎo)致已復(fù)制的穩(wěn)定態(tài)mRNA大量減少。

RNA干擾：指將與靶基因的mRNA同源互補的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后并被切割成21～23個核苷酸長度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的mRNA結(jié)合并導(dǎo)致其降解，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。本文檔共73頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期六\13點2分RNAi——一種新的遺傳工具RNAi是植物、果蠅、線蟲和包括哺乳動物在內(nèi)的許多生物抵抗病毒感染和限制轉(zhuǎn)座子運動的一種自然存在的防御機制。RNAi可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，來制備特定基因缺失表型的個體，從而研究該基因的功能.這項技術(shù)在疾病的基因治療上也有光明的應(yīng)用前景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達(dá)，或者由蛋白過量表達(dá)引起的疾病。

本文檔共73頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期六\13點2分(二)、RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

1994年Cogoni等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象，此稱為基因壓制(quelling)。共抑制現(xiàn)象(cosuppression)

上世紀(jì)90年代初，美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實驗組在對矮牽牛(petunias)的研究中發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達(dá)，反而使原有的色素基因也受到了抑制。本文檔共73頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期六\13點2分1995年，康乃爾大學(xué)的SuGuo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)的par-1基因?qū)嶒炛邪l(fā)現(xiàn)：反義RNA與正義RNA（對照）都能切斷par-1基因的表達(dá)。該研究小組一直未能給這個意外以合理解釋。

GuoS,KemphuesKJ,ParL.Cell,1995,81:611-620.秀麗新小桿線蟲轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灧戳xRNA與正義RNA？反義RNA-與靶核酸(如mRNA或有義DNA)鏈互補的RNA分子，可抑制靶核酸的功能。正義RNA-與mRNA對應(yīng)的RNA分子。本文檔共73頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期六\13點2分RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

1998年，F(xiàn)ire和Mello（美）首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。他們發(fā)現(xiàn)SuGuo博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起：將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，其抑制基因表達(dá)的效率比純化后的反義RNA至少高2個數(shù)量級。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾。

FireA,XuS,MontgomeryME,etal.Nature.1998,391:806-811.本文檔共73頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期六\13點2分Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe.（對照，缺mex-3

，不著色）(B)Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex-3RNA(purplestaining).（正常野生型，紫）(C)Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex-3antisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainmex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.（野生型+反義RNA，淺紫）(D)Late4-cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex-3;nomex-3RNAisdetected.(TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon-overlapping.)

（野生型+雙鏈RNA，不著色）Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA.NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridization（原位雜交）of4-cellstageembryos.本文檔共73頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期六\13點2分“沉默”是金Fire與Mello獲2006年諾貝爾獎本文檔共73頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期六\13點2分在1999年一年內(nèi),發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細(xì)胞中。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNA干擾現(xiàn)象。2000年提出RNAi作用機制模型。HannondSMetal.Nature,2000,404(6775):293-296ZamorePD.Cell,2000,101(1):25-332001年，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。Nature，2001，411（6836）：494－498RNAi技術(shù)被《Science》評為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。本文檔共73頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期六\13點2分2002年5月，Lindenbach(美),雙鏈RNA→艾滋病病毒細(xì)胞→減少艾滋病病毒基因表達(dá)90%以上。2002年7月,Novina等用RNAi技術(shù)實現(xiàn)了HIV1病毒的阻抑。2002年7月,McCaffrey(美)等人,雙鏈RNA+肝炎Ｃ病毒-標(biāo)志基因→鼠肝臟→抑制標(biāo)志基因的表達(dá)/肝炎Ｃ病毒基因的表達(dá)。利用RNAi可以直接和有效地起到抗病毒的作用。本文檔共73頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期六\13點2分共抑制、基因壓制和RNAi→dsRNA→降解靶mRNA→抑制靶基因的表達(dá)。均屬于PTGS！dsRNA導(dǎo)入線蟲→RNAi；dsRNA注射線蟲體腔→RNAi；dsRNA浸潤線蟲/dsRNA的工程菌喂養(yǎng)線蟲→RNAi。dsRNA導(dǎo)入植物→RNAi；同樣，dsRNA注射植物韌皮部→RNAi；吸附500bp基因片段的金屬片插入植物→侵入點組織發(fā)生RNAi。RNAi普遍存在于各種生物中,具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達(dá)mRNA的生物學(xué)功能。本文檔共73頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期六\13點2分（三）、RNA干擾的機制

dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈。Dicer：屬于RNaseⅢ家族的一員，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶，能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA。siRNA(smallinterferingRNA)：小干擾RNA，是長度為21-23個nt大小的雙鏈RNA，為RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子。名詞解釋：本文檔共73頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期六\13點2分

DicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNA本文檔共73頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期六\13點2分siRNA本文檔共73頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期六\13點2分RISC(RNA-inducingsilencingcomplex)：RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，是一種核蛋白復(fù)合物，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性。RdRP（RNA-dependentRNApolymerases）：依賴RNA的RNA聚合酶，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞。本文檔共73頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期六\13點2分RISC:RNA-InducedSilencingComplexExonucleaseHomologysearchactivityEndonucleaseHelicase5’3’TargetmRNAOH3’5’P核酸外切酶

解旋酶

核酸內(nèi)切酶

本文檔共73頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期六\13點2分dsRNA介導(dǎo)的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步：第一步（起始階段）較長dsRNA在ATP參與下，被RNaseⅢ的特異核酸酶切割加工成21~23nt的，由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA的兩條單鏈末端為5’-磷酸和3’-羥基，且3’端均有2個突出的核苷酸。Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域。Dicer的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動物等機體中被發(fā)現(xiàn)。步驟本文檔共73頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期六\13點2分第二步（效應(yīng)階段）siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)?；罨腞ISC在單鏈siRNA引導(dǎo)下識別互補的mRNA，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而干擾基因表達(dá)。本文檔共73頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期六\13點2分RNAi的放大效應(yīng)機制siRNA不僅可引導(dǎo)RISC切割靶RNA，而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNaseⅢ核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進(jìn)入合成-切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大RNAi作用。這種合成-切割的循環(huán)過程稱為隨機降解性PCR（randomdegradativePCR）。本文檔共73頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期六\13點2分GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.異常的單鏈RNA依賴RNA的RNA聚合酶特異性核酸內(nèi)切酶RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物本文檔共73頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期六\13點2分①RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制；②RNAi具有很高的特異性：只有dsRNA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi；只有針對編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾；注射同源dsRNA可以引起內(nèi)源性mRNA特異性的降解；dsRNA不得短于21個堿基，大于30bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾，而是細(xì)胞非特異性和全面的基因表達(dá)受抑制凋亡；RNAi具有高效性：

RNAi抑制基因表達(dá)具有很高的效率，可達(dá)到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，這是通過催化放大的方式進(jìn)行的；RNAi干擾的幾個重要生物學(xué)特征本文檔共73頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期六\13點2分RNAi具有很好的穩(wěn)定性：siRNA分子3′端有突出的非配對堿基的雙鏈分子，在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定存在3-4d，以3′端懸垂TT堿基的雙鏈RNA尤為穩(wěn)定，半衰期遠(yuǎn)長于反義寡聚核苷酸。

RNAi的可傳播性和遺傳性：RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳給F1，但F2往往恢復(fù)為野生型。RNAi效應(yīng)的依賴性：只有連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能產(chǎn)生長期效應(yīng)，否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng)。RNAi作用迅速，mRNA快速降解；本文檔共73頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期六\13點2分miRNA及其作用機制miRNA(microRNA):

微小RNA，指長度約21～25nt的小分子單鏈RNA，位于基因組的非編碼區(qū)，進(jìn)化上高度保守，可在翻譯水平上對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的RNA家族。其介導(dǎo)的沉默機制也屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。miRNA基因的表達(dá)具有特定模式:階段特異性和組織特異性，在不同組織中表達(dá)有不同類型的miRNA，在生物發(fā)育的不同階段里有不同的miRNA表達(dá)。本文檔共73頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期六\13點2分miRNA的作用機制本文檔共73頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期六\13點2分相同點:長度都約22nt左右；同是Dicer產(chǎn)物，因此具有Dicer產(chǎn)物的特點；二者生成都需Argonaute家族蛋白的存在；同是RISC的組分。miRNA與siRNA比較本文檔共73頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期六\13點2分來源不同：siRNA來源于轉(zhuǎn)基因或病毒RNA，由長dsRNA轉(zhuǎn)變而來；miRNA來源于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，是細(xì)胞內(nèi)RNA的固有組分之一，由具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的pre-miRNA轉(zhuǎn)變而來；結(jié)構(gòu)不同：siRNA主要以雙鏈形式存在，其3’端存在2個非配對的堿基，通常為UU；miRNA主要以單鏈形式存在；對靶RNA的特異性不同：siRNA與靶mRNA完全互補配對結(jié)合；miRNA與靶RNA并不完全互補，存在錯配現(xiàn)象。靶序列有一個核苷酸突變，就會影響到siRNA的作用功能，但不會影響到miRNA的功能；作用形式不同：siRNA主要在轉(zhuǎn)錄后通過降解mRNA發(fā)揮作用，而miRNA只在蛋白質(zhì)翻譯水平上負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。不同點:本文檔共73頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期六\13點2分（四）、RNA干擾的研究方法一般技術(shù)路線本文檔共73頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期六\13點2分（五）、RNA干擾的應(yīng)用

1.基因功能研究由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具。已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。

本文檔共73頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期六\13點2分2.病毒性疾病的治療

使用RNAi技術(shù)來阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細(xì)胞。某研究小組設(shè)計合成的lenti病毒載體引入siRNA，激發(fā)RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5（化介素受體，HIV-1的輔因子）進(jìn)入人體外周Ｔ淋巴細(xì)胞，而不影響另一種HIV-1主要的coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加?！滩”疚臋n共73頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期六\13點2分2.病毒性疾病的治療