第十章發(fā)光免疫技術詳解演示文稿

第十章發(fā)光免疫技術詳解演示文稿本文檔共46頁；當前第1頁；編輯于星期六\12點47分優(yōu)選第十章發(fā)光免疫技術本文檔共46頁；當前第2頁；編輯于星期六\12點47分

第一節(jié)概述

本文檔共46頁；當前第3頁；編輯于星期六\12點47分發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學發(fā)光等。

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光照發(fā)光（photoluminescence）是指發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復至基態(tài)時，發(fā)射出較長波長的可見光（熒光）。

生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。本文檔共46頁；當前第5頁；編輯于星期六\12點47分

化學發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學反應過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學反應時，吸收了反應過程中所產(chǎn)生的化學能，使反應的產(chǎn)物分子或反應的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。一、化學發(fā)光本文檔共46頁；當前第6頁；編輯于星期六\12點47分

一些化學反應能釋放足夠的能量把參加反應的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個反應產(chǎn)物分子，則這種反應過程叫直接化學發(fā)光。反應過程可簡單地描述如下：A十BC*C*C＋h·γ其中γ為光子，C*表示C處于單線激發(fā)態(tài)。

本文檔共46頁；當前第7頁；編輯于星期六\12點47分若激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學反應的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)光，這種過程叫間接化學發(fā)光。反應過程可表示如下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ本文檔共46頁；當前第8頁；編輯于星期六\12點47分化學發(fā)光效率（φCL）決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學激發(fā)效率（φCE）和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率（φEM）。化學發(fā)光反應的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)所決定，每一個發(fā)光反應都具有其特征性的化學發(fā)光光譜和不同的化學發(fā)光效率。二、化學發(fā)光效率本文檔共46頁；當前第9頁；編輯于星期六\12點47分化學發(fā)光免疫分析目前分類按發(fā)光劑不同分為1.發(fā)光酶免疫測定技術（CLEIA）

2.化學發(fā)光免疫測定技術(CLIA)

3.電化學發(fā)光免疫測定技術(ECLIA)本文檔共46頁；當前第10頁；編輯于星期六\12點47分第二節(jié)化學發(fā)光劑和標記技術本文檔共46頁；當前第11頁；編輯于星期六\12點47分在化學發(fā)光反應中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學發(fā)光劑或發(fā)光底物。

一、化學發(fā)光劑本文檔共46頁；當前第12頁；編輯于星期六\12點47分能作為化學發(fā)光劑的條件：①發(fā)光的量子產(chǎn)率高；②它的物理-化學特性要與被標記或測定的物質(zhì)相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；④其化學發(fā)光常是氧化反應的結(jié)果；⑤在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性。本文檔共46頁；當前第13頁；編輯于星期六\12點47分㈠直接化學發(fā)光劑

直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應，它們在化學結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。

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1.吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應體系的發(fā)光體。

本文檔共46頁；當前第15頁；編輯于星期六\12點47分2．三聯(lián)吡啶釕

三聯(lián)吡啶釕[RU(bpy)3]2+是電化學發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應。三聯(lián)吡啶釕本文檔共46頁；當前第16頁；編輯于星期六\12點47分電化學發(fā)光劑反應原理

本文檔共46頁；當前第17頁；編輯于星期六\12點47分㈡酶促反應發(fā)光劑：是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應發(fā)光劑。1．魯米諾及其衍生物

2．AMPPD本文檔共46頁；當前第18頁；編輯于星期六\12點47分1．魯米諾魯米諾發(fā)光原理本文檔共46頁；當前第19頁；編輯于星期六\12點47分魯米諾增強發(fā)光反應原理本文檔共46頁；當前第20頁；編輯于星期六\12點47分2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕本文檔共46頁；當前第21頁；編輯于星期六\12點47分1.碳二亞胺（EDC）縮合法

二、發(fā)光劑的標記技術C--O本文檔共46頁；當前第22頁；編輯于星期六\12點47分2.過碘酸鈉氧化法

本文檔共46頁；當前第23頁；編輯于星期六\12點47分3．重氮鹽偶聯(lián)法本文檔共46頁；當前第24頁；編輯于星期六\12點47分4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法

本文檔共46頁；當前第25頁；編輯于星期六\12點47分

1．發(fā)光劑的選擇2．被標記蛋白質(zhì)的性質(zhì)3．標記方法的選擇4．原料比5．標記率6．溫度7．純化與保存影響標記的因素本文檔共46頁；當前第26頁；編輯于星期六\12點47分第三節(jié)化學發(fā)光免疫分析的類型

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用吖啶酯直接標記抗體(抗原)，與待測標本中相應的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。一、直接化學發(fā)光免疫分析本文檔共46頁；當前第28頁；編輯于星期六\12點47分發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學發(fā)光的機理本文檔共46頁；當前第29頁；編輯于星期六\12點47分磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術本文檔共46頁；當前第30頁；編輯于星期六\12點47分化學發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯螅侔阉鼈儌魉椭劣嬎銠C數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。二、化學發(fā)光酶免疫分析本文檔共46頁；當前第31頁；編輯于星期六\12點47分該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體(或抗原)，在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標記抗體復合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學發(fā)光。㈠辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析本文檔共46頁；當前第32頁；編輯于星期六\12點47分辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖

本文檔共46頁；當前第33頁；編輯于星期六\12點47分該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶標記抗體(或抗原)，在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。

㈡堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫分析本文檔共46頁；當前第34頁；編輯于星期六\12點47分堿性磷酸酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖

本文檔共46頁；當前第35頁；編輯于星期六\12點47分分析步驟分配樣品,磁顆粒和試劑孵育使反應物結(jié)合在磁場中清洗去除未結(jié)合物質(zhì)加入底物產(chǎn)生信號孵育,促使信號的產(chǎn)生信號檢測本文檔共46頁；當前第36頁；編輯于星期六\12點47分電化學發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。

三、電化學發(fā)光免疫分析本文檔共46頁；當前第37頁；編輯于星期六\12點47分電化學指在陽極表面[Ru(bpy)3]2+和TPA同時失去電子發(fā)生氧化反應。自由基TPA+●失去一個質(zhì)子（H+），成為自由基TPA●，這是一個強還原劑。TPA●將一個電子遞給Ru(bpy)33+，而TPA被氧化。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+*在衰減時發(fā)射一個波長為620nm的光子?；瘜W發(fā)光包括本文檔共46頁；當前第38頁；編輯于星期六\12點47分電化學發(fā)光免疫分析示意圖本文檔共46頁；當前第39頁；編輯于星期六\12點47分磁性微粒直徑2.8μm，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體積小，懸浮于反應體系中，形成均一穩(wěn)定的液相，在磁場中易于分離。本文檔共46頁；當前第40頁；編輯于星期六\12點47分電化學發(fā)光免疫測定示意圖本文檔共46頁；當前第41頁；編輯于星期六\12