基因治療演示文稿

基因治療演示文稿1本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分（優(yōu)選）第六講基因治療2本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分一、基因治療的策略

內(nèi)容提要二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

四、治療基因的受控表達(dá)三、基因干預(yù)五、基因治療的應(yīng)用研究3本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

一、基因治療的策略TheStrategyofGeneTherapy4本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

（一）基因置換（genereplacement）

定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過(guò)定位重組，以導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。5本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分又稱為基因打靶(genetargeting）定點(diǎn)整合的條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與染色體上的DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實(shí)現(xiàn)?；蛲粗亟M技術(shù)6本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分要實(shí)現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術(shù)使相應(yīng)的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細(xì)胞的基因缺陷部位。定向?qū)氲陌l(fā)生率約1/100萬(wàn)，采用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達(dá)1/10。7本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分（二）基因添加

基因添加或稱基因增補(bǔ)（geneaugmentation）:通過(guò)導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。類型:在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過(guò)導(dǎo)入正常基因的表達(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來(lái)不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。8本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分（三）基因干預(yù)基因干預(yù)（geneinterference）:采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。9本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分（四）自殺基因治療自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無(wú)毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。10本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分自殺基因的作用機(jī)制

11本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分?TK/GCV單純皰疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無(wú)毒的核苷類似物丙氧鳥(niǎo)苷（ganciclovir,GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。?CD/5-FC大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在細(xì)胞內(nèi)將無(wú)毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU）。1.自殺基因系統(tǒng)12本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

旁觀者效應(yīng):“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。

2.旁觀者效應(yīng)13本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分（五）基因免疫治療通過(guò)將抗癌免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。14本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

TheTechniqueofGeneTransfer15本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分基因治療的兩種途徑載體目的基因invivoexvivo靶細(xì)胞16本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù)：

1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。17本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。18本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分Retrovirus

（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒

19本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分20本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分（1）兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR。

逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

（2）LTR由U3、R和U5三部分組成。（3）病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ψ）及剪接供體位點(diǎn)(SD)和剪接受體位點(diǎn)(SA)。

（5）含有負(fù)鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS)和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)(PPT)。(1)在U3內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子；(2)U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)；(3)在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號(hào)。

(1)gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；(2)pol基因，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；(3)env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

21本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分22本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

——由兩部分組成：(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(2)輔助細(xì)胞株(如PA317)23本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分Retroviralpackagingsystem24本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)

①逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體識(shí)別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。

②逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。

③前病毒可以高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。

④包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。

25本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)

隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。26本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體

腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無(wú)包膜DNA病毒。它通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。

腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。27本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分28本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分腺病毒的優(yōu)點(diǎn)1.基因?qū)胄矢?，?duì)人類安全；2.宿主范圍廣；3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無(wú)關(guān)；4.重組腺病毒可通過(guò)口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因；29本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

腺病毒載體缺點(diǎn)2.宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。3.有兩個(gè)環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。4.靶向性差。

1.不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細(xì)胞，導(dǎo)入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機(jī)會(huì)增多，表達(dá)時(shí)間相對(duì)較短。(1)腺病毒產(chǎn)生過(guò)程中與293輔助細(xì)胞內(nèi)E1區(qū)序列發(fā)生同源重組；(2)腺病毒載體與被治療的患者體內(nèi)已感染的野生型腺病毒，甚至乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒發(fā)生重組。30本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

（3）腺病毒相關(guān)病毒載體腺病毒相關(guān)病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無(wú)包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。AAVVirusParticles31本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒復(fù)制基因,CAP:編碼衣殼蛋白的基因32本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分AAV的特點(diǎn)●以潛伏感染為主；●病毒基因組與細(xì)胞共存；●只要宿主細(xì)胞正常，AAV基因表達(dá)就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)；●若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因，AAV基因表達(dá)從而使AAV病毒復(fù)制；●產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。33本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對(duì)人類無(wú)致病性。AAV可以高效定點(diǎn)整合至人19號(hào)染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點(diǎn)整合可以避免隨機(jī)整合可能帶來(lái)的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并可受到周圍基因的調(diào)控，兼具逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點(diǎn)。

34本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

AAV載體的缺陷：

AAV載體容量小，目前最多只能容納5kb外源DNA片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。在40%-80%的成人中存在過(guò)感染，可能會(huì)引起免疫排斥。35本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分

2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。

36本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期六\2點(diǎn)26分脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖37本文檔共39頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期