第三章 質(zhì)譜法

第三章質(zhì)譜法1第一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)譜用途一、研究有機物離子裂解機理；

1956年，麥式重排。二、測定有機物分子量三、運用質(zhì)譜推導有機分子結(jié)構(gòu)。 例如1963年利用質(zhì)譜配合紅外光譜就測定了生物堿白堅木瑞素的結(jié)構(gòu)。第二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四MassSpectrometersProtectSoldiersinIraq

MassspectrometersactassensitivechemicalwarfaredetectorstoprotecttroopsinwaronIraq.第三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四生物質(zhì)譜蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定；氨基酸序列分析；蛋白質(zhì)的質(zhì)量肽譜；蛋白質(zhì)突變體分析以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的測定；配位體結(jié)合的研究；酶的活性部位研究和蛋白質(zhì)折疊和高級結(jié)構(gòu)的研究；核酸片段分子質(zhì)量的測定；寡核苷酸序列分析；核酸修飾部位的鑒定；多糖和寡糖的結(jié)構(gòu)分析。第五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四APPLICATION第六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)譜發(fā)展歷史1897年，英國劍橋Cavendish實驗室的Thomson研制，發(fā)現(xiàn)了氖的同位素，分辨率10。1919年，Aston,速度聚焦質(zhì)譜儀，測出氖同位素的豐度比為10：1，分辨率130。1934年，雙聚焦質(zhì)譜儀，大大提高了分辨率。二戰(zhàn)期間，用于美國原子彈制造計劃（研究235U）。1943年，進入民用，石油分析。50年代，出現(xiàn)新型質(zhì)量分析器，四極濾質(zhì)器（1953），脈沖飛行時間分析器（1955），及新的離子化手段，火花離子源、二次離子源，氣質(zhì)聯(lián)用。60年代以后，新的離子化方法：FI，F(xiàn)D，CI，激光離子化，ICP，F(xiàn)AB，ESI，復雜的質(zhì)譜儀推出，離子探針，三級四極桿，四極桿飛行時間，磁場四極，磁場飛行時間，離子回旋共振等，液質(zhì)聯(lián)用。1974年等離子體質(zhì)譜，1981年快原子轟擊質(zhì)譜，1988年，電噴霧電離質(zhì)譜，90年代以后，EPI-MS，MALDI-MS用于生物間非共價鍵作用研究，聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速。第七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四日本科學家田中耕一(KoichiTanaka)1959年出生于日本富山縣首府富山市，1983年獲日本東北大學學士學位，現(xiàn)任職于京都市島津制作所，為該公司研發(fā)工程師，分析測量事業(yè)部生命科學商務中心、生命科學研究所主任。他對化學的貢獻類似于約翰·芬恩，因此也得到了1／4的獎金。美國科學家約翰·芬恩1917年出生于美國紐約市，1940年獲耶魯大學化學博士學位，1967年到1987年間任該大學教授，1987年起被聘為該大學名譽教授，自1994年起任弗吉尼亞聯(lián)邦大學教授。他因為“發(fā)明了對生物大分子進行確認和結(jié)構(gòu)分析的方法”和“發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析法”而獲得今年諾貝爾化學獎1／4的獎金。瑞士科學家?guī)鞝柼亍ぞS特里希1938年生于瑞士阿爾貝格，1964年獲瑞士巴塞爾大學無機化學博士學位，從1980年起擔任瑞士蘇黎世聯(lián)邦高等理工學校的分子生物物理學教授，還任美國加利福尼亞州拉霍亞市斯克里普斯研究所客座教授。他因“發(fā)明了利用核磁共振技術(shù)測定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的方法”而獲得2002年諾貝爾化學獎一半的獎金。2002年諾貝爾化學獎獲得者第九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四一、質(zhì)譜分析原理二、儀器與結(jié)構(gòu)三、聯(lián)用儀器

第一節(jié)基本原理與質(zhì)譜儀第十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器1.氣體擴散2.直接進樣3.氣相色譜1.電子轟擊2.化學電離3.場致電離4.激光

1.單聚焦2.雙聚焦3.飛行時間4.四極桿

質(zhì)譜儀需要在高真空下工作：離子源（10-310-5Pa

）

質(zhì)量分析器（10-6Pa

）1．大量氧會燒壞離子源的燈絲；2．用作加速離子的幾千伏高壓會引起放電；3．引起額外的離子－分子反應，改變裂解模型，譜圖復雜化。一、質(zhì)譜分析原理第十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)譜儀第十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四電離室原理與結(jié)構(gòu)儀器原理圖原理與結(jié)構(gòu)第十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四在磁場存在下，帶電離子按曲線軌跡飛行；

離心力=向心力；m

2/R=H0eV曲率半徑：

R=（m

）/eH0

質(zhì)譜方程式：m/e=(H02R2)/2V離子在磁場中的軌道半徑R取決于：m/e、H0、V改變加速電壓V,可以使不同m/e

的離子進入檢測器。質(zhì)譜分辨率=M/M

（分辨率與選定分子質(zhì)量有關(guān)）加速后離子的動能:(1/2)m

2=eV

=[(2V)/(m/e)]1/2質(zhì)量分析器原理第十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四二、儀器與結(jié)構(gòu)第十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四FTICRMSWithESIAndMALDI第十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四儀器內(nèi)部結(jié)構(gòu)三、聯(lián)用儀器第十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四聯(lián)用儀器（THEGC/MSPROCESS）SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD第十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四

1．樣品的離子化；2．離子的分析檢測（分離管）；3．信號記錄、數(shù)據(jù)采集與處理。

質(zhì)譜過程

一．質(zhì)譜儀 進樣系流、離子源、加速電場、離子分析器、檢測器。第十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四 一）進樣系統(tǒng) 1：直接進樣桿（DIP)： 2：加熱貯槽進樣器： 3：聯(lián)用技術(shù)進樣：GC-MS、LC-MS。進樣系統(tǒng)第二十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第二十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四根據(jù)樣品性質(zhì)、狀況，如揮發(fā)性、極性、純度等進行選擇，才能取得良好結(jié)果。1、固體和大多數(shù)液體的純有機化合物，先用易揮發(fā)的溶劑配成溶液，置入特制的樣品杯，由樣品桿（探針桿）送入預真空室，抽除溶劑后再送入離子源。進入離子源的樣品，通?？杀粯悠窏U上的特殊裝置加熱、汽化后再進入離子化室。2、對于氣體及沸點不高的易于揮發(fā)的液體，一般將貯樣器抽成真空，并加熱至150℃。樣品用微量注射器注入，氣化后壓入離子源中。3、對于混合物組成的樣品，一般可利用與質(zhì)譜聯(lián)機的氣相色譜或高壓液相色譜儀分離成單組分，然后，各個組分逐個地通過特殊的聯(lián)機接口，進入離子源，進行各純組分的質(zhì)譜測定。第二十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四1．電子轟擊離子源 （electionimpact，EI）

使具有一定能量的電子直接作用于樣品分子，使其電離。（一般為70ev）

二）離子源第二十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四EI第二十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第二十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第二十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第二十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第二十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第二十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四 EI優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，穩(wěn)定，質(zhì)譜圖再現(xiàn)性好，易于操作。電離效率高。

EI缺點：分子離子峰太弱；并且有些分子本身由于分子量太大或極性太強，無法順利氣化。所以要用軟電離方法。第三十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四 2．化學電離離子源 (chemicalionization，CI) CI適用于能夠進入氣相，但分子離子峰很弱的化合物，例如長鏈胺、脂、醇等。

CI第三十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第三十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四例:CH4＞第三十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四生成的CH5+、C2H5+活性離子再與樣品分子M發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應：第三十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四上述生成的（MH）＋、（M-H）＋也可寫成（M＋1）＋和（M一1）＋。因此，采用化學電離法生成的分子離子峰不是M峰，而是(M+1)峰和(M-1)峰，且相對豐度很大，在確定分子量時要注意這一點。第三十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四化學電離法的優(yōu)點即使對于不穩(wěn)定的有機化合物，也可得到相對豐度較大的分子離子峰，有利于分子量的測定。化學電離法缺點碎片離子峰較少，可提供的有關(guān)結(jié)構(gòu)方面的信息少?，F(xiàn)在多將化學電離法和電子轟擊法配合使用，這樣可互相取長補短。除CH4外，化學電離法常用的反應氣體還有H2,N2,C3H8等。第三十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四CI和EI比較CI和EI不同，樣品分子不是與電子碰撞，而是與試劑離子碰撞而離子化的，如果用烷烴作試劑氣，CI通常產(chǎn)生質(zhì)子化的樣品分子。質(zhì)子化的部位通常是具較大的質(zhì)子親和力的雜原子。質(zhì)子化的分子也可能裂解，丟失包括雜原子的碎片。由于C-C鍵斷裂的可能性在CI中較少，CI中碎片離子較少。CI和EI是相互補充的。第三十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四 3．場致電離(fieldionization,FI)和場解吸(fielddesorption,FD)

場致電離中，金屬陽極和陰極之間的距離很近，通常小于lmm。在這兩極之間施加幾千伏甚至上萬伏穩(wěn)定直流電壓，于是在陽極的尖端（其曲率半徑約為2.5mm)附近可產(chǎn)生強度約為107V/cm的強電場，該強電場可以把尖端附近不到lmm處的樣品分子中的電子拉走，形成分子離子。然后和其它離解方法一樣，把正離子引出加速，并聚焦成離子束。FI,FD第三十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四場解吸電離法的原理類似于場致電離法，但在樣品引入方式上有所不同。將用作場離子發(fā)射體的細絲（一般是經(jīng)過活化的鎢絲）放在樣品溶液中浸一下，少量樣品就沾在上面。待溶劑揮發(fā)后樣品分子就吸附在發(fā)射體上，在細絲上通以電流使樣品解吸，并擴散到高場強的場發(fā)射區(qū)域進行電離。與固體的氣化能相比，解吸能要小得多。所以場解吸電離法是一種溫和的電離方法。它產(chǎn)生的分子離子峰的相對豐度比場致電離法產(chǎn)生的還要大。第三十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四下圖是氯霉素分別通過電子轟擊法、場致電離法和場解吸電離法得到的質(zhì)譜。采用電子轟擊法，氯霉素得不到分子離子峰，它極易裂解為m/z=170,152的碎片離子。采用場致電離法可得到相對豐度約為6％的分子離子峰,m/z=322，采用場解吸電離法測得的分子離子峰，其相對豐度約為26％。第四十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第四十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四FD優(yōu)點：特別適合于對難氣化和熱穩(wěn)定性差的樣品作定性鑒定和結(jié)構(gòu)測定。如肽類化合物、糖、有機酸的鹽、有機金屬化合物等。

FD缺點：峰比較少；測定技術(shù)難度較大，重現(xiàn)性不太理想。第四十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四 4．快原子轟擊 （fastatombombardment,FAB） FAB的具體做法是將試樣分散于一種底物中，將試樣溶液涂布在一個金屬靶上，用數(shù)千ev的惰性氣體粒子對準靶心攻擊。這時，原來的離子，都被“濺射”而進入氣相，并被導入偏轉(zhuǎn)區(qū)而被測量。

FAB第四十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第四十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四FAB適用于揮發(fā)性極低、強極性或離子型的化合物；或?qū)崦舾小⒎肿恿枯^大的極性有機分子。但是FAB質(zhì)譜通常沒有分子離子峰，分子量信息來源于加成離子（MH+等）。加成離子常脫水生成強峰，所以確定未知物的分子量并非是輕而易舉的。第四十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四 5．基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption-ionization,MALDI）

MALDI第四十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第四十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第四十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四優(yōu)點：

a.使一些難于電離的樣品電離，且無明顯的碎裂，得到完整的被分析物的分子的電離產(chǎn)物，特別是在生物大分子：肽類化合物、核酸等取得很大成功。b.由于應用的是脈沖式激光，特別適合于與飛行時間質(zhì)譜計相配，因而常見MALDI-TOFMS這個術(shù)語。第四十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四

6．大氣壓電離（atomsphericpressureionization,API） API主要應用于LC-MS聯(lián)用。它包括電噴霧電離（ESI）和大氣壓化學電離（APCI）。第五十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四ESI第五十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第五十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四APCI第五十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四 三）離子分析器（質(zhì)量分析器） 質(zhì)量分析器的作用是將離子源中形成的離子按質(zhì)荷比值的大小不同分開。離子分析器第五十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四

1．單聚焦質(zhì)譜計 a．分辨率較低，其分辨率小于1000，只能分辨單位質(zhì)量b．掃描速度不高。

第五十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四單聚焦質(zhì)譜儀是一種低分辨率的儀器。其分辨率小于1000，只能分辨單位質(zhì)量。有機質(zhì)譜法常常要求得到高分辨率的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及準確的質(zhì)量測定結(jié)果，即要求儀器能分辨名義質(zhì)量相同而準質(zhì)量不同的離子并給出具6位有效數(shù)字的質(zhì)量測定結(jié)果。這需要性能更好的儀器。第五十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第五十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四正離子從電場中獲得的勢能zE應等于其受到加速后的動能1/2mv2。zE=1/2·mv2式中z——正離子電荷，庫倫（coulunmbs）；

E——高電場電勢；

m——正離子質(zhì)量；

v——正離子速度。第五十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四正離子經(jīng)加速后，進入一磁場，并在磁場力FH的作用下沿曲率半徑為R的圓周作圓運動。此時，磁場力FH=向心力Fc已知磁場力FH=Hzv（式中H為磁場強度）而向心力Fc=mv2/R（式中R為曲率半徑）故Hzv=mv2/Rv=HzR/m（質(zhì)譜基本方程）第五十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四代入式zE=1/2·mv2得m/z=H2·R2/2E式中的m/z稱為離子的質(zhì)荷比(masstochargeratio）。從中可以看到，正離子在磁場中的運動軌跡取決于E,H和M/Z，若E,H一定，則正離子的軌道半徑R只與它的質(zhì)荷比有關(guān)。第六十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第六十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四2．雙聚焦質(zhì)譜計 在磁分析器前（后）加一扇形電場（能量分析器）。是一個速度分離器,起到能量色散作用或稱能量過濾作用。從而實現(xiàn)方向和能量雙聚焦。提高了分辨率。第六十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第六十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四

3．

飛行時間質(zhì)譜計 （timeofflight,TOF-MS）

TOF第六十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四 a.

檢測離子的質(zhì)荷比沒有上限，這特別適合于生物大分子的測定。 b.

由于要求兩種盡可能同時飛行，也就特別適合于與脈沖產(chǎn)生離子的電離過程相搭配，例MALDI-TOF。 c.

靈敏度高。d.

掃描速度快，適于研究極快的過程。e.

結(jié)構(gòu)簡單，便于維護。 缺點：分辨率隨質(zhì)荷比的增加而降低。第六十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第六十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四第六十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四MALDI

-TOF第六十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四QuadrupoleMS第六十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期四

四極質(zhì)量分析器和扇形磁場的質(zhì)量分析器在原理上是截然不同的。后者靠離子動量的差別把不同質(zhì)荷比的離子分開；而四極質(zhì)量分析器則是完全靠質(zhì)