第七章 發(fā)酵工藝控制

第七章發(fā)酵工藝控制第一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四第三頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四有一個(gè)好的菌種以后要有一個(gè)配合菌種生長(zhǎng)的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來(lái)。目標(biāo)是得到最大的比生產(chǎn)速率和最大的生產(chǎn)率。

發(fā)酵過程工藝控制的目的第四頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四發(fā)酵過程受到多因素又相互交叉的影響如菌本身的遺傳特性、物質(zhì)運(yùn)輸、能量平衡、工程因素、環(huán)境因素等等。因此發(fā)酵過程的控制具有不確定性和復(fù)雜性。為了全面的認(rèn)識(shí)發(fā)酵過程，本章首先要告訴大家分析發(fā)酵過程的基本方面，在此基礎(chǔ)上再舉一些例子，說明如何綜合分析發(fā)酵過程及進(jìn)行優(yōu)化放大。發(fā)酵過程的控制第五頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四發(fā)酵過程控制是發(fā)酵的重要部分控制難點(diǎn)：過程的不確定性和參數(shù)的非線性同樣的菌種，同樣的培養(yǎng)基在不同工廠，不同批次會(huì)得到不同的結(jié)果，可見發(fā)酵過程的影響因素是復(fù)雜的，比如設(shè)備的差別、水的差別、培養(yǎng)基滅菌的差別，菌種保藏時(shí)間的長(zhǎng)短，發(fā)酵過程的細(xì)微差別都會(huì)引起微生物代謝的不同。了解和掌握分析發(fā)酵過程的一般方法對(duì)于控制代謝是十分必要的發(fā)酵工藝控制第六頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四一發(fā)酵過程的種類分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)第一節(jié)工業(yè)發(fā)酵的主要類型第七頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、分批發(fā)酵

簡(jiǎn)單的過程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個(gè)過程中菌的濃度、營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時(shí)間變化。發(fā)酵過程的代謝控制第八頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四分批培養(yǎng)中微生物的生長(zhǎng)遲滯期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定期死亡期發(fā)酵過程的代謝控制第九頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四微生物生長(zhǎng)分為：遲滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和死亡期在遲滯期，菌體沒有分裂只有生長(zhǎng)，因?yàn)楫?dāng)菌種接種入一個(gè)新的環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)的核酸、酶等稀釋，這時(shí)細(xì)胞不能分裂。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的與細(xì)胞分裂相關(guān)的物質(zhì)濃度達(dá)到一定程度，細(xì)胞開始分裂，這時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)很快，比生長(zhǎng)速率幾近常數(shù)。這個(gè)時(shí)期稱為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期發(fā)酵過程的代謝控制第十頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四

隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物減少，廢物積累，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降，進(jìn)入減速期和穩(wěn)定期。最后當(dāng)細(xì)胞死亡速率大于生成速率，進(jìn)入死亡期

對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期就開始合成并積累，而次級(jí)代謝產(chǎn)物則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期和穩(wěn)定期大量合成。發(fā)酵過程的代謝控制第十一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，周期短，染菌機(jī)會(huì)少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握缺點(diǎn)產(chǎn)率低，不適于測(cè)定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)酵過程的代謝控制第十二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、補(bǔ)料分批培養(yǎng)

在分批培養(yǎng)過程中補(bǔ)入新鮮的料液，以克服營(yíng)養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過早結(jié)束的缺點(diǎn)。在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時(shí)有所增加。在工廠的實(shí)際生產(chǎn)中采用這種方法很多。發(fā)酵過程的代謝控制第十三頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；可以通過補(bǔ)料控制達(dá)到最佳的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成條件；還可以利用計(jì)算機(jī)控制合理的補(bǔ)料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。缺點(diǎn)由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機(jī)會(huì)發(fā)酵過程的代謝控制第十四頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四3、半連續(xù)培養(yǎng)在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間歇放掉部分發(fā)酵液（帶放）稱為半連續(xù)培養(yǎng)。某些品種采取這種方式，如四環(huán)素發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)放掉部分發(fā)酵液，再補(bǔ)入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。缺點(diǎn)代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大發(fā)酵過程的代謝控制第十五頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四4、連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵過程中一邊補(bǔ)入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積維持恒定。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，整個(gè)過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。發(fā)酵過程的代謝控制第十六頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長(zhǎng)，得到高的產(chǎn)量。由于μ＝D，通過改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)缺點(diǎn)菌種不穩(wěn)定的話，長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)會(huì)引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長(zhǎng)時(shí)間補(bǔ)料染菌機(jī)會(huì)大大增加。發(fā)酵過程的代謝控制第十七頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、發(fā)酵類型需氧發(fā)酵需氧發(fā)酵是由需氧菌在有分子氧存在的條件下進(jìn)行的發(fā)酵過程。氧在微生物的需氧呼吸中作為最終的電子受體。這類發(fā)酵包括絕大多數(shù)的抗生素、氨基酸以及其他代謝產(chǎn)物的發(fā)酵。厭氧發(fā)酵厭氧發(fā)酵是由厭氧菌或兼性厭氧菌在無(wú)分子氧的條件下進(jìn)行的發(fā)酵過程。包括工業(yè)上的乙醇、丙酮、丁醇、乳酸、丁酸等。第十八頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四三、發(fā)酵類型生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型第十九頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四■第一類型（生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型）產(chǎn)物直接來(lái)源于產(chǎn)能的初級(jí)代謝（自身繁殖所必需的代謝），菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成不分開。例如單細(xì)胞蛋白和葡萄糖酸的發(fā)酵第二十頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四■第二類型（部分生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型）

產(chǎn)物也來(lái)源于能量代謝所消耗的基質(zhì)，但產(chǎn)物的形成在與初級(jí)代謝分開的次級(jí)代謝中，出現(xiàn)兩個(gè)峰，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，出現(xiàn)產(chǎn)物形成高峰。例如，檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵。第二十一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四■第三類型（非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型）產(chǎn)物是在基質(zhì)消耗和菌體生長(zhǎng)之后，菌體利用中間代謝反應(yīng)來(lái)形成的，即產(chǎn)物的形成和初級(jí)代謝是分開的。如抗生素發(fā)酵。第二十二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四產(chǎn)物形成與生長(zhǎng)有關(guān)，如酒精、某些酶等?！錾L(zhǎng)關(guān)聯(lián)型第二十三頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四產(chǎn)物的形成速度與生長(zhǎng)無(wú)關(guān)，只與細(xì)胞積累量有關(guān)。如，抗生素?！龇巧L(zhǎng)關(guān)聯(lián)型non-growthassociated

第二十四頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四發(fā)酵過程的中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛，它顯示了發(fā)酵過程中微生物的主要代謝變化。因?yàn)槲⑸飩€(gè)體極微小，肉眼無(wú)法看見，要了解它的代謝狀況，只能從分析一些參數(shù)來(lái)判斷，所以說中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛。這些代謝參數(shù)又稱為狀態(tài)參數(shù)，因?yàn)樗鼈兎从嘲l(fā)酵過程中菌的生理代謝狀況，如pH，溶氧，尾氣氧，尾氣二氧化碳，粘度，菌濃度等第二節(jié)工業(yè)發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)第二十五頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四代謝參數(shù)按性質(zhì)分可分三類：物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、空氣壓力、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、、核酸量等生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力等發(fā)酵過程控制第二十六頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四從檢測(cè)手段分可分為：直接參數(shù)、間接參數(shù)直接參數(shù)：通過儀器或其它分析手段可以測(cè)得的參數(shù)，如溫度、pH、殘?zhí)堑乳g接參數(shù)：將直接參數(shù)經(jīng)過計(jì)算得到的參數(shù)，如攝氧率、KLa等發(fā)酵過程的代謝控制第二十七頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四直接參數(shù)又可分為:在線檢測(cè)參數(shù)和離線檢測(cè)參數(shù)在線檢測(cè)參數(shù)指不經(jīng)取樣直接從發(fā)酵罐上安裝的儀表上得到的參數(shù)，如溫度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速；離線檢測(cè)參數(shù)指取出樣后測(cè)定得到的參數(shù)，如殘?zhí)?、NH2-N、菌體濃度。發(fā)酵過程控制第二十八頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四發(fā)酵過程的代謝控制第二十九頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四一、物理參數(shù)溫度（℃）是指整個(gè)發(fā)酵過程或不同階段中所維持的溫度。它的高低與發(fā)酵過程中酶反應(yīng)速率、氧在培養(yǎng)液中的溶解度和傳遞速率、菌體生長(zhǎng)速率和產(chǎn)物合成速率等有密切關(guān)系。壓力（Pa）發(fā)酵過程中發(fā)酵罐維持的壓力。罐內(nèi)維持正壓可以防止外界空氣中的雜菌侵在培養(yǎng)液中的溶解度有關(guān)，間入，以保證純種的培養(yǎng)。同時(shí)罐壓的高低還與氧和在培養(yǎng)液中的溶解度有關(guān),間接影響菌體的代謝。攪拌轉(zhuǎn)速（r/min)是指攪拌器在發(fā)酵過程中的轉(zhuǎn)動(dòng)速度，通常以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)來(lái)表示。它的大小與氧在發(fā)酵液中的傳遞速率和發(fā)酵液的均勻性有關(guān)。第三十頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四攪拌功率(kW)是指攪拌器攪拌時(shí)所消耗的功率，常指每立方米發(fā)酵液所消耗的功率（它的大小與液相體積氧傳遞系數(shù)有關(guān)?？諝饬髁?V/V.min)是指每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積，它是需氧發(fā)酵中重要的控制參數(shù)之一。它的大小與氧的傳遞和其他控制參數(shù)有關(guān)。一般控制在范圍內(nèi)。粘度(Pa.s)粘度大小可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞形態(tài)的一項(xiàng)標(biāo)志，也能反映發(fā)酵罐中菌絲分裂過程的情況。通常用表觀粘度表示。它的大小可影響氧傳遞的阻力，也可反映相對(duì)菌體濃度。第三十一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四目前發(fā)酵過程主要分析項(xiàng)目如下1、pH

pH與微生物的生命活動(dòng)密切相關(guān)——

酶催化活性pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映——基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細(xì)胞狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況、供氧狀況二、化學(xué)參數(shù)第三十二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、排氣氧、排氣CO2和呼吸熵

排氣氧的濃度表征了進(jìn)氣的氧被微生物利用以后還剩余的氧，因此排氣氧的大小反映了菌生長(zhǎng)的活性，通過計(jì)算可以求得攝氧率（OUR）。

排氣二氧化碳反映了微生物代謝的情況，因?yàn)槲⑸飻z入的氧并不是全部變成二氧化碳的，有的進(jìn)入代謝中間物分子，進(jìn)入細(xì)胞或產(chǎn)物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有機(jī)物降解后會(huì)產(chǎn)生二氧化碳，使排氣二氧化碳大于消耗的氧。第三十三頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四RQ值隨微生物菌種的不同，培養(yǎng)基成分的不同，生長(zhǎng)階段的不同而不同。測(cè)定RQ值一方面可以了解微生物代謝的狀況，另一方面也可以指導(dǎo)補(bǔ)料CER表示單位體積發(fā)酵液?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)釋放的二氧化碳的量呼吸熵＝呼吸熵反映了氧的利用狀況發(fā)酵過程的代謝控制第三十四頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四

一般在發(fā)酵中后期為保證產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，有意使菌體處于半饑餓狀態(tài)，在營(yíng)養(yǎng)限制的條件下，維持產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的速率在較高水平。對(duì)于這種工藝，后期的補(bǔ)料控制是關(guān)鍵。過程中發(fā)現(xiàn)，在補(bǔ)糖開始時(shí)，不但CER、OUR大幅度提高，連RQ也提高約10％，表明通過補(bǔ)糖不但提供了更多的碳源，而且隨著體系內(nèi)葡萄糖濃度提高，糖代謝相關(guān)酶活力也提高，產(chǎn)能增加。發(fā)酵過程的代謝控制第三十五頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四3、糖含量微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成與糖代謝有密切關(guān)系。糖的消耗

反映產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)繁殖情況

反映產(chǎn)物合成的活力菌體生長(zhǎng)旺盛糖耗一定快，殘?zhí)且簿徒档偷每焱ㄟ^糖含量的測(cè)定，可以控制菌體生長(zhǎng)速率，可控制補(bǔ)糖來(lái)調(diào)節(jié)pH，促進(jìn)產(chǎn)物合成，不致于盲目補(bǔ)糖，造成發(fā)酵不正常。糖含量測(cè)定包括總糖和還原糖?？偺侵赴l(fā)酵液中殘留的各種糖的總量。如發(fā)酵中的淀粉、飴糖、單糖等各種糖。

還原糖指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。發(fā)酵過程的代謝控制第三十六頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四4、氨基氮和氨氮氨基氮指有機(jī)氮中的氮（NH2-N），單位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黃豆餅粉、花生餅粉中都有有機(jī)氮。氨氮指無(wú)機(jī)氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌體生長(zhǎng)情況，含氮產(chǎn)物合成情況。但是氮源太多會(huì)促使菌體大量生長(zhǎng)。有些產(chǎn)物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。通過氨基氮和氨氮的分析可控制發(fā)酵過程，適時(shí)采取補(bǔ)氨措施。發(fā)酵后期氨基氮回升，這時(shí)就要放罐，否則影響提取過程。發(fā)酵過程的代謝控制第三十七頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四5、磷含量微生物體內(nèi)磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來(lái)計(jì)算磷含量的是磷酸根。

磷是核酸的組成部分，是高能化合物ATP的組成部分，磷還能促進(jìn)糖代謝。因此磷在培養(yǎng)基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取補(bǔ)磷措施。發(fā)酵過程的代謝控制第三十八頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四6、產(chǎn)物濃度

在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生菌的合成能力和產(chǎn)物積累情況都要通過產(chǎn)物量的測(cè)定來(lái)了解，產(chǎn)物濃度直接反映了生產(chǎn)的狀況,是發(fā)酵控制的重要參數(shù)。而且通過計(jì)算還可以得到生產(chǎn)速率和比生產(chǎn)速率，從而分析發(fā)酵條件如補(bǔ)料、pH對(duì)產(chǎn)物形成的影響。發(fā)酵過程的代謝控制第三十九頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四產(chǎn)物量的特殊表示法1、抗生素效價(jià)的表示抗生素效價(jià)表示抗生素的有效成分的多少，效價(jià)大小用單位（U）來(lái)表示效價(jià)表示方法：重量折算法重量單位類似重量單位特殊單位第四十頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、酶活力酶活力用單位來(lái)表示。由于酶通常不是很純，不能用重量來(lái)表示酶的量。同一種酶用不同的方法測(cè)定會(huì)有不同的酶活單位，容易造成混亂，為此國(guó)際上作了統(tǒng)一規(guī)定，規(guī)定在250C下，以最適的底物濃度，最適的緩沖液離子強(qiáng)度，以及最適的pH諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微克分子底物的酶定量為一個(gè)活性單位。第四十一頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四菌濃度和菌形態(tài)菌形態(tài)和菌濃度直接反映菌生長(zhǎng)的情況。菌形態(tài)顯微鏡觀察菌濃度的測(cè)定是衡量產(chǎn)生菌在整個(gè)培養(yǎng)過程中菌體量的變化，一般前期菌濃增長(zhǎng)很快，中期菌濃基本恒定。補(bǔ)料會(huì)引起菌濃的波動(dòng)，這也是衡量補(bǔ)料量適合與否的一個(gè)參數(shù)。三、生物參數(shù)第四十二頁(yè)，共五十頁(yè)，編輯于2023年，星期四發(fā)酵過程的代謝控制第四十三