動物體細胞核移植概念

歡迎指導(dǎo)！上岡中學(xué)生物研討課明確學(xué)習(xí)目標(biāo)簡述動物細胞的培養(yǎng)過程舉例說出細胞融合和單克隆抗體的制備關(guān)注克隆技術(shù)的倫理問題第三節(jié)動物細胞工程重點、難點、考點動物細胞的培養(yǎng)核移植與體細胞克隆單克隆抗體的制備克隆羊“多利”新華網(wǎng)2010.12.3.消息克隆羊多利重生這4只克隆羊在遺傳上與多莉毫無差異。多莉誕生于14年前，是第一個使用成熟細胞克隆的哺乳動物。

克隆羊多莉(Dolly)已經(jīng)獲得“重生”。最初進行此項克隆研究的英國科學(xué)家又培育出4只克隆羊，被形象地稱之為“Dollies”(多莉的復(fù)數(shù))。它們是多莉的復(fù)制品，在遺傳上與多莉絲毫不差，多莉在7年前離開這個世界。問題導(dǎo)學(xué)1、克隆羊“多利”的重生，采用的是什么技術(shù)？細胞工程技術(shù)2、動物細胞工程技術(shù)到底是干啥的？（定義）在細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)理論指導(dǎo)下，根據(jù)人類的需要一方面深入探索并改造生物的遺傳特性，另一方面應(yīng)用工程技術(shù)手段，大量培養(yǎng)細胞。動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合單克隆抗體制備體細胞克隆細胞核移植動物細胞工程技術(shù)動物細胞工程的基礎(chǔ)范疇動物細胞和組織培養(yǎng)在體外模擬動物體內(nèi)環(huán)境，將動物體細胞或組織，在無菌、溫度適宜和營養(yǎng)充足條件下培養(yǎng)，使其繼續(xù)生長、增值并維持原有結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。討論1、動物細胞培養(yǎng)的原理是什么？2、從動物機體中要取出哪些相關(guān)組織？并解釋原因。3、組織分散成單個細胞的方法是什么？其理論依據(jù)是什么？4、動物細胞體外培養(yǎng)需要滿足哪些條件？動物細胞培養(yǎng)條件：1、無菌、無毒的環(huán)境：（添加一定量的抗生素；定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物。）2、營養(yǎng)物質(zhì)(區(qū)分天然培養(yǎng)基與合成培養(yǎng)基)（無機鹽、葡萄糖、氨基酸、核酸、維生素、動物血清等。）3、溫度和pH：

37℃,7.2-7.44、氣體環(huán)境：

O2和CO2（95%空氣和5%CO2

）3.動物細胞培養(yǎng)過程：用胰蛋白酶等處理動物組織，形成分散的懸浮細胞。動物細胞培養(yǎng)適宜的pH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。說明：分散成單個動物細胞（細胞培養(yǎng)）動物細胞生長特性：細胞貼壁：懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。細胞的接觸抑制：

當(dāng)貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。思考：細胞發(fā)生接觸抑制后如何使細胞繼續(xù)分裂增殖？原代培養(yǎng)：是指從供體獲取組織或細胞后的初次培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)的細胞分離稀釋后轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液胰蛋白酶10代細胞原代培養(yǎng)50代細胞傳代培養(yǎng)細胞株無限傳代細胞系單個細胞加培養(yǎng)液遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)已改變動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）4.動物細胞培養(yǎng)過程：細胞的全能性細胞株、細胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果大量獲得細胞或細胞產(chǎn)物快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的動物血清植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細胞增殖原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較動物細胞培養(yǎng)應(yīng)用大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品（病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體）；培養(yǎng)的動物細胞可以用于檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性；為治療和預(yù)防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù)。思考與探究：如何用細胞培養(yǎng)技術(shù)，為燒傷病人植皮？

取該患者的皮膚進行細胞培養(yǎng),獲得足量的細胞后再移植動物細胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用這只老鼠身上的“人耳”是由我國科學(xué)家曹誼林教授利用細胞工程技術(shù)復(fù)制出來的。器官克隆一例小結(jié)基本概念原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。細胞株和細胞系的區(qū)別：細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。細胞貼壁：懸液中分散的細胞很快貼在瓶壁上，稱為細胞貼壁。接觸抑制：當(dāng)貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖的現(xiàn)象。測試一下1、在動物細胞培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)遺傳物質(zhì)改變的細胞是（）A．細胞系B．細胞株C．原代細胞D．傳代細胞2、下列屬于動物細胞培養(yǎng)與植物細胞培養(yǎng)區(qū)別的是（）A．培養(yǎng)基成分不同B．動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行C．動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能D．動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培養(yǎng)成植株

高度分化的植物組織能表達全能性，但動物細胞與植物細胞不同，動物細胞的全能性會隨著動物細胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能逐漸變?nèi)酢Ｒ虼?，目前還不能用類似植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整的動物個體，用動物體細胞克隆的動物，實際是通過核移植來實現(xiàn)的。<<動物細胞核移植思考：動物細胞培養(yǎng)有沒有發(fā)育成一個新個體？動物體細胞核移植概念:

將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新胚胎最終發(fā)育成動物個體。用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物核移植胚胎細胞核移植體細胞核移植（難度高）受體細胞：去核卵細胞原理：動物體細胞核的全能性動物克隆過程的實際是細胞核移植克隆羊“多利”的產(chǎn)生過程:問題：1）、上述多利羊的成功培育過程表明了什么？也反映出了什么問題？.2）、書上說治療性克隆和生殖性克隆的大討論，你有何觀點，請說出來。你認為生殖性克隆會帶來哪些倫理上的問題？（發(fā)散思維）_________________________。3）、克隆羊“多利”六歲就離開了這個世界，換了關(guān)節(jié)炎和肺病，這表明______________，如果克隆人是否也存在健康隱患？___________________.5）、書上說：“克隆技術(shù)在克服動物種間雜交障礙，創(chuàng)造新物種等方面具有重要的科學(xué)意義和潛在的經(jīng)濟價值?！蹦闳绾卫斫猓?）、你對克隆技術(shù)有哪些期望？（參考教材p57）思考題１、在進行體細胞核移植之前，為何要去掉受體卵母細胞的核？為使核移植動物的遺傳物質(zhì)全部來自有利用價值的動物提供的細胞。２、用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞，為什么？10代以內(nèi)的細胞保持一般保持正常二倍體的核型，未突變3、細胞核移植生產(chǎn)的克隆動物是對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制嗎？為什么？不是，克隆動物絕大部分DNA來自供體細胞核，但核外還有少部分DNA（如線粒體DNA）來自受體卵母細胞4.動物克隆實例很多，為何多莉就舉世聞名呢？在1997年2月英國羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎細胞核移植技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展。實際上，“多莉”的克隆在核移植技術(shù)上沿襲了胚胎細胞核移植的全部過程，但這并不能減低“多莉”的重大意義，因為它是世界上第一例經(jīng)體細胞核移植出生的動物，是克隆技術(shù)領(lǐng)域研究的巨大突破。這一巨大進展意味著：在理論上證明了，同植物細胞一樣，分化了的動物細胞核也具有全能性．

克隆動物的研究意義1.克隆動物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白2.改良動物品種3.治療人類疾病，作為供體4.保護瀕危動物體細胞核移植技術(shù)存在的問題：許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，臟器缺陷，免疫失調(diào)等。布置作業(yè)復(fù)習(xí)細胞培養(yǎng)過程及克隆動物過程學(xué)案后的【鞏固練習(xí)】預(yù)習(xí)細胞融合與單克隆抗體的制備第二課時細胞融合單克隆抗體的制備概念：（略）<<過程4、原理細胞膜的流動性5、最有價值的應(yīng)用制備單克隆抗體3、過程不同DNA的兩個細胞滅活的病毒PEG雜交細胞細胞融合完成的標(biāo)志:細胞核融合成一個核顯微鏡下細胞融合過程主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細胞融合的方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性、植物細胞全能性原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目４、植物、動物細胞融合的比較一、何謂單克隆抗體？只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。②特點：產(chǎn)量低、特異性差、純度低、反應(yīng)不夠靈敏常規(guī)抗體制備一個B淋巴細胞：只分泌一種特異性抗體單克隆抗體雜交瘤細胞小鼠骨髓瘤細胞：能無限增殖融合單克隆抗體

培養(yǎng)①向動物體內(nèi)反復(fù)注射抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從血清中分離所需抗體。制備過程：一篩二篩雜交細胞滅活的病毒等手段小鼠骨髓瘤細胞B淋巴細胞經(jīng)免疫的小鼠提取雜交瘤細胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選能產(chǎn)生特定抗體、培養(yǎng)條件下能無限增殖的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔提取單克隆抗體用專一抗體檢驗陽性單克隆抗體在診斷的應(yīng)用上，具有準確、高效、簡易、快速的優(yōu)點1、作為診斷試劑2、用于治療疾病和運載藥物療效高、毒副作用小的新型藥物－－“生物導(dǎo)彈”應(yīng)用：<<生物導(dǎo)彈1、科學(xué)家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，得到雜交細胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓疤細胞融合的是（）A.經(jīng)過免疫的B淋巴細胞B.沒經(jīng)過免疫的T淋巴細胞

C.經(jīng)過免疫的T淋巴細胞D.沒經(jīng)過免疫的Ｂ淋巴細胞A2、用于動物細胞培養(yǎng)的組織和細胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細胞（）

A.容易產(chǎn)生各種變異B．具有更強的全能性

C.取材十分方便D．分裂增殖的能力強D3.動物細胞培養(yǎng)與植物細胞培養(yǎng)的重要區(qū)別在于()A.培養(yǎng)基不同；

B.動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行；

C.動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能；

D.動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培養(yǎng)成植株。A4、動物細胞融合和植物原生質(zhì)體融合比較，在動物細胞融合中有特殊性的是（

）A、融合的原理B、融合的優(yōu)點C、融合的誘導(dǎo)手段D、融合的過程5、單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞。在這種培養(yǎng)基上不能存活、增殖的細胞是（）①B淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞A、①②③④

B、①③⑤C、①③

D、②④

C

A7、(06江蘇)下圖是單克隆抗體制備流程階段示意圖。（1）_______________技術(shù)是單克隆抗體技術(shù)的基礎(chǔ)。（2）根據(jù)培養(yǎng)基的用途分類，圖中HAT培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基。（3）單克隆抗體與常規(guī)的血清抗體相比，最大的優(yōu)越性是________________。（4）動物細胞融合除了采用植物細胞原生質(zhì)體融合常用的誘導(dǎo)劑外，還可以采用________________。（5）選出的雜交瘤細胞既具備骨髓瘤細胞的_______________特點，又具備淋巴細胞的_______________特點。（6）淋巴細胞是由動物體_________中的______________細胞分化、發(fā)育而來。（7）雜交瘤細胞從培養(yǎng)基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是____________。動物細胞培養(yǎng)選擇特異性強,靈敏度高滅活的病毒在體外大量增殖分泌特異性抗體骨髓造血干細胞主動運輸6、基因型為AaBb的水稻(具有24條染色體)的花粉通過無菌操作，接入試管后，在一定條件下形成試管苗的育種過程。(1)愈傷組織是花粉細胞不斷分裂后的形成的不規(guī)則細胞團，愈傷組織形成中，必須從培養(yǎng)基中獲得__________。(2)要促進花粉細胞分裂生長，培養(yǎng)基中應(yīng)有________和_______兩類激素。(3)愈傷組織分化是指愈傷組織形成芽和根，再由芽發(fā)育成葉和莖。這一過程必須給予光照，其原因是_____________利用光照制造有機物，供試管苗生長。(4)試管苗的細胞核中含有___________條脫氧核苷酸鏈。(5)培養(yǎng)出的試管基因型有

。如果要獲得育種需要的植株，并能繁殖新品種，后面的育種步驟是_________________。

各種營養(yǎng)(水、無機鹽、蔗糖等能量物質(zhì))和小分子有機物生長素、細胞分裂素葉綠體24AB、Ab、ab、aＢ用一定濃度的秋水仙素處理組織培養(yǎng)獲得的幼苗兒科疑難病例討論病例資料一般情況患兒，男，8月，因“發(fā)熱1天”由門診擬“上呼吸道感染”于2013年2月17日

收入院。病例資料現(xiàn)病史：患兒于昨夜無明顯誘因下于家中出現(xiàn)發(fā)熱，體溫39.2℃左右，無咳嗽，無鼻塞，自服“小兒柴桂顆粒”后仍有發(fā)熱，且喂藥后患兒嘔吐1次，非噴射性，嘔出胃內(nèi)容物，無腹瀉，無面色發(fā)紺，無抽搐，即來我院就診。

病來患兒精神偏軟，胃納一般，夜寐欠安，大小便無殊。病例資料個人史、既往史及家族史:未見明顯異常情況。病例資料體格檢查：T

39.7℃，P

122次/分

,R

28次/分，Wt

10kg，神清，精神尚可，前囟未閉，1.0cm*1.0cm，平坦，氣尚平，三凹征陰性，全身未見皮疹，淺表淋巴結(jié)未及腫大，鞏膜無黃染，外耳道無異常分泌物，鼻不塞，咽紅，雙側(cè)扁桃未見腫大，頸軟，無抵抗，兩肺呼吸音粗，未及明顯干濕性啰音，心率122次/分,律齊，未及明顯病理性雜音，腹平軟，未及包塊，肝脾肋下未及，脊椎及四肢無關(guān)節(jié)紅腫疼痛，活動自如，神經(jīng)系統(tǒng)檢查病理征未引出。病例資料入院前輔助檢查：（2013-02-17我院）血常規(guī)+CRP示W(wǎng)BC20.6G/L,N55.3%,L39.47%,HB109g/L，PLT385G/L

，CRP19MG/L。

病例資料初步診斷

急性上呼吸道感染33.47106.615121CRP(mg/L)

41091199352PLT(10^9/L)0.2360.2610.3070.318HCT

8089104105HGB(g/L)2.993.373.894.01RBC(10^12/L)

36.937.924.830.2LY%54.859.974.760.4NE%

22.211.813.624.3WBC(10^9/L)2.252.222.192.17日期BRT+CRP輔助檢查

日期BRT+CRP2.262.273.043.053.07WBC(10^9/L)14.114.317.918.410.5NE%51.72738.942.623.1LY%33.953.839.839.362.8RBC(10^12/L)2.812.712.822.932.99HGB(g/L)7773787979HCT0.2240.210.2260.2340.238PLT(10^9/L)410535814818683CRP(mg/L)19.721722.4918.32<1輔助檢查

日期ESR2.172.222.263.10ESR(mm/h)143393101

日期肝功能2.172.232.263.053.10TP(60.0-83.0g/L)68.304773.18083.9ALB(34.0-54.0g/L)44.126.725.832.734.8BIB24.220.347.347.319.1輔助檢查輔助檢查病毒類：巨細胞病毒抗體IgG陽性(AU/mL)，余均陰性。輔助檢查2.21心臟B超：1.心內(nèi)結(jié)構(gòu)、房室大小、瓣膜活動及血流信號未見明顯異常；2.左心室功能測定正常；3.心包少量積液。B超測定左右冠狀動脈內(nèi)徑返回未見明顯擴張（左冠狀動脈起始段內(nèi)徑1.52mm，右冠狀動脈起始段內(nèi)徑1.81mm）3.8復(fù)查心臟B超：左冠狀動脈起始段內(nèi)徑2.5mm，右冠狀動脈起始段內(nèi)徑3.7mm輔助檢查2.21胸片：兩肺支氣管肺炎。2.25肺部CT:1.兩下肺散在斑片狀密度增高影，考慮炎癥可能；2.右側(cè)胸腔積液；3.兩側(cè)胸膜增