公司培訓(xùn)液相色譜教程演示文稿

公司培訓(xùn)液相色譜教程演示文稿本文檔共69頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\21點15分（優(yōu)選）公司培訓(xùn)液相色譜教程本文檔共69頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\21點15分高效液相法色譜簡介本文檔共69頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\21點15分高效液相色譜法的發(fā)展高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)起始于60年代后期，是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的一種分離分析方法。本文檔共69頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\21點15分HPLC法的分離原理溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時，與固定相(stationaryphase)發(fā)生吸附、分配、離子交換、排阻等作用，由于不同組分理化性質(zhì)不同，與固定相發(fā)生作用的大小、強弱不同，導(dǎo)致在固定相中滯留時間不同，從而先后流出色譜柱。本文檔共69頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\21點15分高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)流程高壓泵進(jìn)樣器檢測器色譜工作站色譜柱本文檔共69頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\21點15分高效液相譜系統(tǒng)本文檔共69頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\21點15分輸液泵

輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2；④液缸容積??；⑤密封性能好，耐腐蝕。本文檔共69頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\21點15分一個輸液泵只能控制一個輸液瓶，即只能用一種溶劑（單一或混合溶劑）進(jìn)行洗脫（等度洗脫）。由于等度洗脫用的流動相組成始終保持恒定，所以只適合組分?jǐn)?shù)目少，性質(zhì)差別不大的樣本的分離。一元泵系統(tǒng)本文檔共69頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\21點15分

對于組分多、性質(zhì)差別大的復(fù)雜樣本在一個條件下難以將各個組分洗脫下來，如在一個分析周期內(nèi)按程序改變流動相的組成（如極性、離子強度和pH值)，使各組分在適當(dāng)條件下得到分離。二元泵系統(tǒng)本文檔共69頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\21點15分

在一個分析周期內(nèi)依據(jù)被測組分的極性而按程序改變流動相組成進(jìn)行洗脫的方法叫做梯度洗脫。優(yōu)點：能縮短分析時間，提高分離度，改善峰形。缺點：基線漂移。在不同儀器或色譜柱上較難重現(xiàn)。本文檔共69頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\21點15分高壓/低壓梯度洗脫系統(tǒng)及特點由兩臺以上輸液泵將兩種以上溶劑分別送入混合器混合，然后進(jìn)入色譜柱的洗脫方式稱為高壓梯度洗脫。特點：梯度準(zhǔn)確度好。由一臺輸液泵通過比例閥和在線脫氣機完成的梯度洗脫方法稱為低壓梯度洗脫。特點：需要配備在線脫氣機，易發(fā)生時間滯后效應(yīng)。本文檔共69頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\21點15分現(xiàn)在的HPLC輸液泵多用柱塞往復(fù)泵，它的液缸容積可小至0.1ml，易于清洗和更換流動相，特別適合于梯度洗脫，而且由于改變電機轉(zhuǎn)速就能方便地調(diào)節(jié)流量，所以流量不受柱阻影響，輸液泵壓力可達(dá)400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，雙泵系統(tǒng)較好地克服了輸出脈沖性較大的缺點。本文檔共69頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\21點15分按雙泵的連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。本文檔共69頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\21點15分溶劑的純度要高，否則重現(xiàn)性差；梯度混合的溶劑互溶性要好；進(jìn)樣之前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑峰；每次梯度洗脫之后要對色譜柱進(jìn)行充分的平衡，使之回到流動相組成的初始濃度。示差折光檢測器對流動相組成變化敏感，不能進(jìn)行梯度系統(tǒng)。梯度洗脫注意事項本文檔共69頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\21點15分檢測器檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴８鶕?jù)檢測原理可將其分為選擇性檢測器和通用型檢測器。本文檔共69頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\21點15分本文檔共69頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\21點15分幾種常用檢測器的主要性能UV熒光電化學(xué)質(zhì)譜蒸發(fā)光信號流速影響溫度影響檢測限(g/ml)池體積(μl)梯度洗脫樣品破壞吸光度無小10-102~10適宜無熒光強度無小10-132~7適宜無電流有大10-13＜1不宜無離子流強度無––適宜有散射光強無小10-9––適宜無本文檔共69頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\21點15分檢測器的保養(yǎng)紫外燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時打開檢測器，20分鐘后可以進(jìn)行檢測；在分析完閉后，先關(guān)紫外燈。（頻繁的開關(guān)燈會縮短燈的使用壽命）樣品池要常清洗本文檔共69頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\21點15分柱溫箱HPLC分析一般在室溫條件下進(jìn)行,但適當(dāng)提高柱溫能降低流動相黏度和柱前壓，有利于改善傳質(zhì)和提高分析速度，有利于提高保留時間的重現(xiàn)性。本文檔共69頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\21點15分高效液相色譜分類方法與特點本文檔共69頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\21點15分

HPLC分類根據(jù)固定相可以分為：液-固色譜、液-液色譜及鍵合相色譜；根據(jù)分離原理可以分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、離子對色譜、排阻色譜等。本文檔共69頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\21點15分鍵合相色譜分離原理：認(rèn)為吸附、分配兼有之。正相色譜：采用極性固定相（如硅膠、氨基與腈基鍵合相），流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入甲醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。本文檔共69頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\21點15分反相色譜：一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。本文檔共69頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\21點15分

離子交換色譜：固定相是離子交換樹脂。緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

改變流動相的pH值和離子強度可以改善分離。本文檔共69頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\21點15分排阻色譜法

固定相為有一定孔徑的多孔性填料。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。本文檔共69頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\21點15分離子對色譜法主要用于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。本文檔共69頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\21點15分反相離子對色譜法常用ODS柱，流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測組分保留時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關(guān)。本文檔共69頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\21點15分三、HPLC使用注意事項本文檔共69頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\21點15分HPLC的日常操作條件最好是恒溫、恒濕溫度：15~30℃

相對濕度<80%房間應(yīng)有良好的通風(fēng)空調(diào)或其他設(shè)備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器避免光線直射遠(yuǎn)離高電干擾、高振動設(shè)備本文檔共69頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\21點15分

（一）啟動前檢查

1.流動相是否過濾2.水與有機溶劑混合時溫度變化大，必須待恢復(fù)到室溫時方可使用，否則易產(chǎn)生氣泡。3.更換流動相時注意兩種流動相必須具有互溶性，本文檔共69頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\21點15分更換溶劑的一般方法：（1）取少量準(zhǔn)備更換的流動相放在清潔的燒杯中，取出吸濾器，將吸濾頭放在燒杯中用超聲波振蕩器振動清洗干凈；（2）打開排液閥，按清洗鍵（purge），用新流動相清洗泵中的流動相；（3）關(guān)閉排液閥，啟動泵，清洗流路；（4）連接色譜柱和檢測器，用新流動相平衡色譜柱。本文檔共69頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\21點15分4.更換不互溶性流動相時應(yīng)先用異丙醇進(jìn)行置換，然后每步都按（1）~（4）進(jìn)行。5.更換緩沖鹽流動相時，用純水清洗，每步都按1~4進(jìn)行。6.保持貯液瓶清潔，對專用貯液瓶應(yīng)定期清洗；用試劑瓶作貯液瓶時，要經(jīng)常更換。本文檔共69頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\21點15分7.定期在稀硝酸溶液中超聲、清洗過濾器，保持過濾器暢通無阻。8.每天開始使用儀器時注意放空排氣，確保泵頭、流動池以及其它流路系統(tǒng)中無氣泡存在。開機或更換流動相時應(yīng)從0.2ml/min開始，待壓力穩(wěn)定后再升高流速，每次0.2ml本文檔共69頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\21點15分（二）泵的使用與維護(hù)注意事項1.防止任何固體微粒進(jìn)入泵體（0.2um或0.45um的微孔濾膜過濾）。2.流動相應(yīng)先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性。3.流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)。4.泵工作時防止溶劑瓶內(nèi)的流動相用完，否則空泵運轉(zhuǎn)會磨損柱塞、密封圈，導(dǎo)致漏液。本文檔共69頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\21點15分5.輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形造成漏液。6.使用緩沖液后用兩通管連接管路及檢測池，先用純水沖洗，然后用甲醇沖洗。管路及檢測池沖洗干凈后再沖洗色譜柱。反相柱先用含5%~7%甲醇的水沖洗色譜柱（此時不要再連接檢測池），然后用甲醇或甲醇-水混合液沖洗。本文檔共69頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\21點15分7.緩沖鹽不得在色譜柱中過夜。8.緩沖液使用前必須過濾。9.磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液易受到細(xì)菌和霉菌的影響，不得放置過夜，應(yīng)臨用現(xiàn)制。注意：用緩沖液后不能直接換用有機溶劑本文檔共69頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\21點15分流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能貯存在塑料容器中。容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。容器應(yīng)定期清洗，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。本文檔共69頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\21點15分1.使用流動相溶解樣品--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時尤為重要

--保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀2.進(jìn)樣前最好使用<0.45um的膜進(jìn)行過濾。樣品處理本文檔共69頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\21點15分

手動進(jìn)樣閥操作注意點：1）樣品溶液必須用0.45um的濾膜過濾2）進(jìn)樣應(yīng)使用液相色譜專用平頭進(jìn)樣針3）轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在進(jìn)樣閥的中間位置4）常用密封墊的材質(zhì)適用pH<10,樣品溶液pH小于10,換特氟隆材質(zhì)的密封墊pH10-135）每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥定子轉(zhuǎn)子針頭密封墊彈簧不銹鋼套進(jìn)樣閥的保養(yǎng)本文檔共69頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\21點15分色譜柱的保養(yǎng)8945612370xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:::::::輸液時不要打開排液閥柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動本文檔共69頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\21點15分當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈要注意流動相的脫氣避免使用高粘度的溶劑作為流動相進(jìn)樣樣品要提純控制絕對進(jìn)樣量加預(yù)柱預(yù)柱本文檔共69頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\21點15分預(yù)柱套預(yù)柱芯

預(yù)柱套預(yù)柱芯本文檔共69頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\21點15分本文檔共69頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\21點15分裝色譜柱時應(yīng)按色譜柱上的箭頭方向安裝。一般不要倒沖色譜柱。每天工作結(jié)束后用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?清洗后塞住兩頭當(dāng)分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機溶劑保存本文檔共69頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\21點15分注意：只能使用色譜級的溶劑!

不能使用舊的或未經(jīng)過濾的緩沖溶液流動相的選擇采用“HPLC”級溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配（質(zhì)譜、ELSD不能用無機鹽緩沖液、用UV檢測器時注意溶劑的截止波長本文檔共69頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\21點15分分析過程中常見故障

及解決方法本文檔共69頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\21點15分被污染的溶劑吸濾頭產(chǎn)生的問題故障特征：“鬼峰”保留時間不斷改變(由于過濾頭堵塞或部分堵塞)清洗步驟：1.水；2.稀硝酸； 3.水；4.異丙醇；5.水注意：砂芯式濾頭不能超聲本文檔共69頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\21點15分流路中形成氣泡引起的問題改變保留時間和峰面積

由于流動相中形成氣泡對液流的不良影響及泵中形成氣泡使液流波動峰變形柱中氣泡形成和累積使流動相繞流尖峰或鋸齒狀噪聲檢測池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲本文檔共69頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\21點15分輸液泵常見故障及相應(yīng)排除措施故障

可能原因

解決辦法

無流動相流出，又無壓力指示泵內(nèi)有大量氣體打開泄壓閥，排液密封圈損壞更換壓力和流量不穩(wěn)有氣泡打開泄壓閥排液單向閥內(nèi)有異物稀硝酸超聲清洗壓力高堵壓力低漏本文檔共69頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\21點15分按規(guī)則操作盡量避免問題

如出現(xiàn)問題應(yīng)盡快預(yù)測可能出現(xiàn)的問題的原因，一次僅改變一種因素有助于正確判斷問題所在的原因?qū)ψ约核龅墓收吓懦ぷ髯骱糜涗?使用HPLC時注意本文檔共69頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\21點15分氣相色譜法簡介本文檔共69頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\21點15分一、色譜知識簡介二、氣相色譜儀器簡介主要內(nèi)容本文檔共69頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\21點15分氣相色譜知識簡介

GC:用氣體作為流動相的色譜法，利用物質(zhì)的沸點、極性及吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離優(yōu)點:選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快缺點:僅適于蒸汽壓低,沸點低的樣品本文檔共69頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\21點15分GC分類：按色譜柱分：填充柱GC和開管柱GC（毛細(xì)管柱）按固定相分：氣固色譜和氣液色譜按分離機理分：分配色譜和吸附色譜按進(jìn)樣方式分：常規(guī)色譜，頂空色譜和裂解色譜等本文檔共69頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\21點15分

1.氣固色譜：吸附機理；如永久性氣體：CO、CO2、N2、O2等。

2.氣液色譜：分配機理；適用于較低分子量和低沸點且350℃不易分解的物質(zhì)組分的分離分析。，另外對于難揮發(fā)的物質(zhì)可以采用衍生化法使其沸點降低，如高級醇、高沸點酸可以通過酯化使其生成對應(yīng)的酯。本文檔共69頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\21點15分氣相色譜儀的基本配置簡介氣路系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)本文檔共69頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\21點15分本文檔共69頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\21點15分氫氣和氮氣不允許用完，當(dāng)瓶內(nèi)壓力低于500kPa時即應(yīng)停止使用。氣體流路連接凈化管，管中可以裝填5A分子篩，以便吸附氣源中微量水和低分子量的有機雜質(zhì)。在管內(nèi)5A分子篩之后裝入少量變色硅膠。當(dāng)分子篩失效不能吸收水分時，水開始被變色硅膠吸收，硅膠由藍(lán)變紅說明分子篩需要重新活化。本文檔共69頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\21點15分5A分子篩的活化方法是在500一600℃(不應(yīng)超過600℃)加熱2—3h，或在真空下130℃加熱1h。變色硅膠在120℃加熱活化。凈化管入口和出口應(yīng)加標(biāo)志，出口應(yīng)當(dāng)用少許紗布、脫脂棉輕輕塞上，嚴(yán)防凈化劑粉塵流出凈化管吹進(jìn)色譜儀。有時在凈化管里還加入活性炭，以吸附分子量較大的有機雜質(zhì)。本文檔共6