丙二醛的測(cè)定

植物組織中丙二醛的測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理：植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。丙二醛在酸性和高溫條件，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,5,5一三甲基惡唑2,4-二酮），在532nm處有最大光吸收，在600nm處有最小光吸收，該復(fù)合物的吸光系數(shù)為155[mmol/（L.cm）]，可按公式:A532-A600=155000XCXL算出MDA濃度C（＞mol/L），進(jìn)一步算出單位重量鮮組織中MDA含量（umol/g）。式中，A532和A600分別表示532nm和600nm處的吸光度值。L為比色杯厚度（cm）。需要指出的是，植物組織中糖類物質(zhì)對(duì)MDA-TBA反應(yīng)有干擾作用。為消除這種干擾，經(jīng)試驗(yàn)，可用下列公式消除由蔗糖引起的誤差。C（umol/L）=6.45（A532-A600）-0.56A450式中：A450、A532和A600分別表示450nm、532nm和600nm處的吸光度值。算出植物樣品提取液中MDA的濃度后，可進(jìn)一步算出其在植物組織中的含量。實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一） 實(shí)驗(yàn)材料植物的根或葉片。（二） 試劑1、 5%三氯乙酸（TCA）。2、 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液：稱取硫代巴比妥酸0.6g溶于5%TCA溶解并用其定容至l00mL。（三） 儀器設(shè)備研缽，恒溫水浴鍋，分光光度計(jì)，離心機(jī)，天平，刻度試管，移液管實(shí)驗(yàn)步驟MDA的提取稱取植物材料1g，剪碎，加入2mL5%TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8mLTCA進(jìn)一步研磨，勻漿在4000r/min離心10min，上清液為樣品提取液。顯色反應(yīng)和測(cè)定吸取離心的上清液2mL（對(duì)照加2mL蒸餾水），加入2mL0.6%TBA溶液，搖勻。將試管放入沸水浴中煮沸10min（自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計(jì)時(shí)），取出試管并冷卻，3000r/min離心15min，取上清液并量其體積。以0.6%TBA溶液為空白測(cè)定532nm、600nm和450nm處的吸光度值。結(jié)果計(jì)算肱％濃度（冽口￡區(qū)'尸、提取液體積（戒）MDA含量（.mol/g） 樣品重量您）對(duì)如。實(shí)驗(yàn)四十二植物體內(nèi)丙二醛含量的測(cè)定一、 目的通過實(shí)驗(yàn)，掌握植物體內(nèi)丙二醛含量測(cè)定的原理及方法。二、 原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的。它的含量與植物衰老及逆境傷害有密切關(guān)系。測(cè)定植物體內(nèi)丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性條件下加熱與組織中的丙二醛產(chǎn)生顯色反應(yīng)，生成紅棕色的三甲川（3、5、5一三甲基惡唑2、4一二酮），三甲川最大的吸收波長(zhǎng)在532nm。但是測(cè)定植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在450nm處，在532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中丙二醛與硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。此外在532nm波長(zhǎng)處尚有非特異的背景吸收的影響也要加以排除。低濃度的鐵離子能顯著增加硫代巴比妥酸與蔗糖或丙二醛顯色反應(yīng)物在532、450nm處的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛與硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)中需要有一定的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100—300rg?g-iDw，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加AFe，+的終濃度為0.5nmol?L-1。在532nm、600nm和450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，即可計(jì)算出丙二醛含量。三、材料、儀器設(shè)備及試劑材料：植物葉片。儀器設(shè)備：離心機(jī)，分光光度計(jì)；電子分析天平；恒溫水??；研缽；試管；移液管（1ml、5ml）、試管架；移液管架；洗耳球；剪刀。試劑：10%三氯乙酸；0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。四、實(shí)驗(yàn)步驟丙二醛的提取稱取受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片1g，加入少量石英砂和10%三氯乙酸2ml，研磨至勻漿，再加8ml10%三氯乙酸進(jìn)一步研磨，勻漿以4000r/min離心10min，其上清液為丙二醛提取液。顯色反應(yīng)及測(cè)定取4支干凈試管，編號(hào)，3支為樣品管（三個(gè)重復(fù)），各加入提取液2ml，對(duì)照管加蒸餾水2ml，然后各管再加入2ml0.6%硫代巴比妥酸溶液。搖勻，混合液在沸水浴中反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液分別在532、600和450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A）值。五、丙二醛含量計(jì)算:由于蔗糖一TBA反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為450nm，毫摩爾吸收系數(shù)為85.4X10-3,MDA—TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532nm的毫摩爾吸收系數(shù)分別是7.4X10-3和155X10-3°532nm非特異性吸光值可以600nm波長(zhǎng)處的吸光值代表。按雙組分分光光度法原理，建立方程組，解此方程組即可求出MDA及可溶性糖濃度。方程組：

A=(85.4X10-3)?C糖450(A532-A600)=(155X10-3)?Cmda+(7.4X10-3)?C糖解得：600 MMA450CA450C糖=85.4X10-3=11.71A450(mmol?L-i)Cmda=6.45(A532-A600)-0.56A450-(umol?L-1)公式中：A頓一在450nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值A(chǔ)；一在532nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值A(chǔ)：一在600nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值*—1.55X105為摩爾比吸收系數(shù)C糖、Cmda分別是反應(yīng)混合液中可溶性糖、MDA的濃度。1.按下式計(jì)算提取液中MDA濃度反應(yīng)液體積(ml)反應(yīng)液體積(ml