動(dòng)物產(chǎn)品中馬、驢、騾源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法

I動(dòng)物產(chǎn)品中馬、驢、騾源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物原材料及動(dòng)物相關(guān)產(chǎn)品中馬、驢、騾源性成分檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物原材料及動(dòng)物相關(guān)產(chǎn)品的定性檢測(cè)。本標(biāo)準(zhǔn)不適用于動(dòng)物深加工產(chǎn)品（如阿膠及其附屬產(chǎn)品）的檢測(cè)，本方法的最低檢出限（LOD）為100mg/kg。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)SN/T1193基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。熒光定量PCR技術(shù)在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。Ct值每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。已知來源于單一動(dòng)物源性成分的樣品從肉眼上可判斷出其材料來自于同一個(gè)生物有機(jī)體的樣品（如一張皮毛等固定的動(dòng)物組織）或有證據(jù)表明其來源于同一種生物有機(jī)體且未經(jīng)其他源性成分干擾過的樣品。原理騾為馬和驢雜交的后代，含有馬和驢的核基因雙重遺傳背景。利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，根據(jù)動(dòng)物核基因組中編碼肌肉肌酸激酶（creatinekinasemuscle，ckm）基因上各物種間（尤其是馬和驢）基因序列差異而進(jìn)行動(dòng)物源性成分鑒定。利用各類方法提取得到高純度DNA，以提取的DNA為模板進(jìn)行內(nèi)參照基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，以確定樣品DNA的提取效率和PCR反應(yīng)體系是否滿足要求。通過特異性引物和標(biāo)記熒光物質(zhì)探針進(jìn)行馬、驢、騾源性成分的熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的強(qiáng)弱判定實(shí)現(xiàn)對(duì)馬、驢、騾源性成分的定性分析。其中，馬源性成分應(yīng)有馬的熒光信號(hào)，驢源性成分應(yīng)只有驢的熒光信號(hào)，騾源性成分同時(shí)含有馬和驢的熒光信號(hào)。因此，被檢樣品如檢出馬源性成分，未檢出驢源性成分，可斷定樣品含有馬成分。如檢出驢源性成分，未檢出馬源性成分，可斷定樣品含有驢成分。如檢出馬和驢源性成分，且樣品為已知來源于單一動(dòng)物源性成分的樣品，可斷定樣品含有騾成分。儀器和設(shè)備電子天平，感量0.01g。微量可調(diào)移液器（最大量程為10μL、20μL、100μL、1000μL）。恒溫水浴鍋。磁力攪拌器。高速冷凍離心機(jī)。二級(jí)生物安全柜。高壓滅菌鍋。普通冰箱：4℃，-20℃。pH計(jì)。核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。試劑和材料試劑的配制及試驗(yàn)中的操作規(guī)范應(yīng)按GB/T27403和SN/T1193的規(guī)定執(zhí)行。除另有規(guī)定外，試劑應(yīng)為分析純或化學(xué)純級(jí)別，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。檢測(cè)用引物和Taqman探針序列（詳見表1）。檢測(cè)用引物和Taqman探針名稱序列（5’—3’）目的基因內(nèi)參照5’端引物內(nèi)參照3’端引物內(nèi)參照探針F:5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’R:5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’P:5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TRAMA-3’真核生物18SrRNA基因馬成分5’端引物馬成分3’端引物馬成分探針F:5'-CCTGGTATGGAAACATTGGAATC-3'R:5'-CTTGGAGAGCGAGCACAGC-3'P:5’-FAM-CCGGAAACAAAGTGAG-MGBNFQ-3’馬核基因組ckm基因驢成分5’端引物驢成分3’端引物驢成分探針F:5'-CCTGGTATGGAAACATCGGAATC-3'R:5'-CTCGGAGAGCGAGCACAGC-3'P:5’-FAM-CCCGACACAAAGTGAG-MGBNFQ-3’驢核基因組ckm基因推薦賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成的Taqman-MGB探針，或等效試劑。CTAB緩沖液：55mmol/LCTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris，調(diào)pH至8.0。121℃高壓滅菌20min，備用。TE緩沖液：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。蛋白酶K：20mg/μL。RNA酶溶液：5μg/μL。Tris飽和酚。三氯甲烷。異戊醇。異丙醇。70%乙醇。商品化2×熒光定量PCR預(yù)混液：推薦寶日醫(yī)生物技術(shù)（XX）有限公司的PremixExTaq、XX諾唯贊生物科技有限公司的AceQqPCRProbeMasterMix，或等效試劑。樣品制備應(yīng)將試樣充分粉碎混合均勻后進(jìn)行DNA的提取。固體樣品要充分粉碎研磨，必要時(shí)用液氮研磨。檢驗(yàn)步驟DNA提取稱取0.2g～0.3g已制備好的樣品于2mL離心管中，加入1000μLCTAB緩沖液和40μL蛋白酶K，震蕩混勻，65℃溫浴30min，每隔10min振蕩混勻。12000g離心10min，吸取1mL上清液至2mL離心管中，勿吸取管內(nèi)雜質(zhì)。向離心管中加入500μL體積比為25:24:1的酚-三氯甲烷-異戊醇的混合液，劇烈震蕩，12000g離心12min。吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，劇烈震蕩，12000g離心10min。棄上清液，用65℃預(yù)熱的雙蒸水溶解DNA。加入5μLRNA酶，37℃溫浴30min。加入200μL體積比為24:1的三氯甲烷-異戊醇混合液，劇烈震蕩，12000g離心12min。吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，震蕩均勻，12000g離心10min。棄上清，70%乙醇洗滌一次，12000g離心1min。棄上清液，晾干后加入50μLTE緩沖液溶解DNA，-20℃保存。DNA提取也可使用等效的DNA提取試劑盒替代，推薦XX諾唯贊生物科技有限公司的FastPureTMTissueDNAIsolationMiniKit，或等效試劑盒。DNA濃度及純度的測(cè)定取適量的DNA模板溶液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280，DNA濃度計(jì)算按式（1）計(jì)算： C=A×N×50 （SEQ標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)公式\*ARABIC1）式中：C——DNA濃度，單位為納克每微升（ng/μL）；A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)；50——吸光值A(chǔ)260為1時(shí)，相對(duì)應(yīng)雙鏈DNA的濃度常數(shù)。當(dāng)A260/A280比值在1.8～2.0之間時(shí)，DNA模板適宜熒光定量PCR擴(kuò)增。若檢測(cè)DNA模板濃度不在規(guī)定范圍內(nèi)，可適當(dāng)增加樣品采樣量或增加熒光定量PCR反應(yīng)過程中模板量或減少溶解DNA的溶劑的量，提高濃度，以保證檢測(cè)的有效性。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見表2。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系試劑成分體積（單位：μL）2×熒光定量PCR預(yù)混液引物F（10μM）引物R（10μM）探針P（5μM）樣品DNA（10ng/μL～100ng/μL）ddH2012.51111補(bǔ)至25實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)95℃預(yù)變性5min；95℃變性5s，60℃退火30s，45個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照檢驗(yàn)過程中分別設(shè)內(nèi)參照、馬源性陽性對(duì)照、驢源性陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照。以任一真核生物提取的DNA為內(nèi)參照、以馬提取的DNA為馬源性陽性對(duì)照、以驢提取的DNA為驢源性陽性對(duì)照、以已知不含有馬、驢、騾成分的樣品提取的DNA為陰性對(duì)照，以滅菌水為空白對(duì)照。所有反應(yīng)均設(shè)置兩個(gè)平行反應(yīng)體系。質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無效，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：空白對(duì)照：無熒光對(duì)數(shù)增長，相應(yīng)的Ct值＞40.0；陰性對(duì)照：無熒光對(duì)數(shù)增長，相應(yīng)的Ct值＞40.0；馬源性陽性對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值＜30.0；驢源性陽性對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值＜30.0；內(nèi)參照：有熒光對(duì)數(shù)增長且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值＜30.0。結(jié)果判定及表述結(jié)果判定在符合第9部分的情況下，被檢樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)：如馬源性Ct值≤35.0，則判定為被檢樣品馬源性成分陽性；如驢源性Ct值≤35.0，則判定為被檢樣品驢源性成分陽性；如Ct值≥40.0，則判定相應(yīng)被檢源性成分陰性；如35.0＜Ct值＜40.0，判為結(jié)果可疑，需要重新檢測(cè)。重新檢測(cè)需從提取DNA開始重新檢測(cè)，由于為定性檢測(cè)，可從多個(gè)方面提高檢測(cè)率，根據(jù)各種具體情況在可選使用量的幾個(gè)因素中重新調(diào)整優(yōu)化檢測(cè)過程，如增加樣品取樣量、減少溶解DNA的TE劑量，增加PCR反應(yīng)中加入的模版量、適量增加PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)等。如再次擴(kuò)增后Ct值仍為＜40.0，則判定相應(yīng)被檢成分陽性；如再次擴(kuò)增后Ct值≥40.0，則判定相應(yīng)被檢成分陰性。熒光定量PCR擴(kuò)增的馬和驢DNA序列參見附錄A。結(jié)果表述結(jié)果為馬源性成分陽性且驢源性成分陰性者，表述為“檢出馬成分”。結(jié)果為驢源性成分陽性且馬源性成分陰性者，表述為“檢出驢成分”。結(jié)果為馬和驢源性成分陽性者，表述為“檢出馬和驢源性成分”，如樣品為已知來源于單一動(dòng)物源性成分的樣品，可表述為“檢出騾成分”。結(jié)果為馬和驢源性成分陰性者，表述為“未檢出馬、驢、騾成分”。防污染措施檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。

（資料性附錄）

擴(kuò)增產(chǎn)物序列馬ckm基因?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增的DNA序列（93bp）FP1CCTGGTATGGAAACATTGGAATCAGCGCCGGAAACAAAGTGAGCTCTCGGGACCTGACAG61