基因的表達(dá)與調(diào)控上詳解演示文稿

基因的表達(dá)與調(diào)控上詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)優(yōu)選基因的表達(dá)與調(diào)控上當(dāng)前第2頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

組成性表達(dá)(constitutiveexpression)

適應(yīng)性表達(dá)(adaptiveexpression）二、基因表達(dá)的方式當(dāng)前第3頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

1、組成型表達(dá)：

指不大受環(huán)境變動(dòng)而變化的一類基因表達(dá)。某些基因在一個(gè)個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，通常被稱為管家基因(housekeepinggene)。無論表達(dá)水平高低，管家基因較少受環(huán)境因素影響，而是在個(gè)體各個(gè)生長階段的大多數(shù)或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。區(qū)別于其他基因，這類基因表達(dá)被視為組成型表達(dá)(constitutiveexpression)。當(dāng)前第4頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

2、適應(yīng)性表達(dá)指環(huán)境的變化容易使其表達(dá)水平變動(dòng)的一類基因表達(dá)。應(yīng)環(huán)境條件變化基因表達(dá)水平增高的現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)(induction)，這類基因被稱為可誘導(dǎo)的基因(induciblegene)；相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達(dá)水平降低的現(xiàn)象稱為阻遏(repression)，相應(yīng)的基因被稱為可阻遏的基因(repressiblegene)。在一定機(jī)制控制下，功能上相關(guān)的一組基因，無論其為何種表達(dá)方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達(dá)，即為協(xié)調(diào)表達(dá)(coordinateexpression)，這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)(coordinateregulation)。當(dāng)前第5頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)三、基因表達(dá)的規(guī)律

——時(shí)間性和空間性1、時(shí)間特異性（temporalspecificity）按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按特定的時(shí)間順序發(fā)生，稱之為基因表達(dá)的時(shí)間特異性。多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時(shí)間特異性又稱階段特異性(stagespecificity)。

當(dāng)前第6頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)2、空間特異性(spatialspecificity)基因表達(dá)伴隨時(shí)間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實(shí)際上是由細(xì)胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細(xì)胞或組織特異性(cellortissuespecificity)。在個(gè)體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個(gè)體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達(dá)的空間特異性。當(dāng)前第7頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)四、基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義適應(yīng)環(huán)境、維持生長和增殖（原核、真核）

維持個(gè)體發(fā)育與分化（真核）當(dāng)前第8頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)五、基因表達(dá)調(diào)控的層次轉(zhuǎn)錄水平基因結(jié)構(gòu)活化轉(zhuǎn)錄起始（基因表達(dá)基本控制點(diǎn)）轉(zhuǎn)錄后水平轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)翻譯水平翻譯調(diào)控翻譯后加工蛋白質(zhì)降解當(dāng)前第9頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)六、轉(zhuǎn)錄水平----基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素

（一）特異DNA序列（二）調(diào)節(jié)蛋白（三）RNA聚合酶當(dāng)前第10頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)原核生物的特異DNA序列

原核生物基因表達(dá)與調(diào)控是通過操縱子機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。操縱子

是由功能上相關(guān)聯(lián)的多個(gè)編碼序列（結(jié)構(gòu)基因）及其上游的調(diào)控序列成簇串聯(lián)在一起構(gòu)成的一個(gè)轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)單位。調(diào)控序列包括操縱序列(O)、啟動(dòng)序列(P)和調(diào)節(jié)基因(I/R)等組件。

（一）特異DNA序列當(dāng)前第11頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

操縱子調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)序列操縱序列編碼序列（結(jié)構(gòu)基因）

表達(dá)

轉(zhuǎn)錄ICAPPOZYA阻遏蛋白結(jié)合部位RNA聚合酶結(jié)合部位啟動(dòng)序列（P）：其中的-35區(qū)-10區(qū)是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位。多順反子mRNA阻遏蛋白（負(fù)性調(diào)節(jié)）

（正性調(diào)節(jié)）多種蛋白質(zhì)當(dāng)前第12頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)真核生物的特異DNA序列

真核生物基因組中含有可以調(diào)控自身基因表達(dá)的特異DNA序列，稱為順式作用元件。

順式作用元件能夠被各種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白特異識(shí)別和結(jié)合，從而影響基因表達(dá)活性。啟動(dòng)子順式作用元件又分增強(qiáng)子沉默子當(dāng)前第13頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)1)順式作用元件(cis-actingelement)——可影響自身基因表達(dá)活性的DNA序列BADNA編碼序列轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)不同真核生物的順式作用元件中也會(huì)發(fā)現(xiàn)一些共有序列，如TATA盒、CAAT盒等，這些共有序列是RNA聚合酶或特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)前第14頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)（二）調(diào)節(jié)蛋白原核生物的調(diào)節(jié)蛋白（3類）特異因子

決定RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)序列的特異識(shí)別和結(jié)合能力；

(如，RNA聚合酶的因子)阻遏蛋白

通過與操縱序列結(jié)合，阻遏基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用；（由調(diào)節(jié)基因表達(dá)的阻遏蛋白）激活蛋白

與啟動(dòng)子上游DNA序列結(jié)合，促進(jìn)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮正性調(diào)控作用。(如，CAP—分解代謝物基因活化蛋白)當(dāng)前第15頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)2.真核生物的調(diào)節(jié)蛋白

反式作用因子

能直接或間接與順式作用元件相互作用，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白，統(tǒng)稱為反式（作用）因子。(trans-actingfactor)

按其功能不同，常有以下三類：

基本轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子共調(diào)節(jié)因子當(dāng)前第16頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)（1）基本轉(zhuǎn)錄因子（TF）是指能夠在啟動(dòng)子部位與核心序列TATA盒和RNAPolⅡ結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物（PIC）的一類調(diào)節(jié)蛋白，以起動(dòng)轉(zhuǎn)錄。與RNA聚合酶(RNAPolⅡ)結(jié)合的(基本)轉(zhuǎn)錄因子有：TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡH,TFⅡJ等。

首先由TFⅡD與啟動(dòng)子TATA盒結(jié)合，然后按一定的時(shí)空順序依次結(jié)合RNAPolⅡ和其它轉(zhuǎn)錄因子，形成PIC。當(dāng)前第17頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)(2)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

這類調(diào)節(jié)蛋白能識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的調(diào)控序列或遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子元件，通過蛋白質(zhì)-DNA相互作用而影響轉(zhuǎn)錄活性。起激活轉(zhuǎn)錄作用——轉(zhuǎn)錄激活因子；起阻遏轉(zhuǎn)錄作用——轉(zhuǎn)錄阻遏因子。（3）共調(diào)節(jié)因子另有一類與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)生蛋白－蛋白相互作用，進(jìn)而影響它們的分子構(gòu)象，影響轉(zhuǎn)錄活性，稱共調(diào)節(jié)因子。如果與轉(zhuǎn)錄激活因子有協(xié)同作用——共激活因子；與轉(zhuǎn)錄阻遏因子有協(xié)同作用——共阻遏因子。當(dāng)前第18頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)7.1原核基因表達(dá)調(diào)控總論7.1.1原核基因表達(dá)調(diào)控的類型與特點(diǎn)1、根據(jù)操縱子對(duì)調(diào)節(jié)蛋白(阻遏蛋白或激活蛋白)的應(yīng)答，正轉(zhuǎn)錄調(diào)控負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)基因RNA調(diào)節(jié)蛋白當(dāng)前第19頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因激活蛋白正轉(zhuǎn)錄調(diào)控正轉(zhuǎn)錄調(diào)控如果在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時(shí)基因是關(guān)閉的，加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被開啟，這樣的調(diào)控正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當(dāng)前第20頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時(shí)基因是表達(dá)的，加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因表達(dá)活性便被關(guān)閉，這樣的調(diào)控負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當(dāng)前第21頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

根據(jù)輔因子(小分子)結(jié)合后調(diào)控效果，可分：

開啟調(diào)控系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄活性——誘導(dǎo)關(guān)閉調(diào)控系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄活性——阻遏操縱子調(diào)控系統(tǒng)的基本類型可誘導(dǎo)負(fù)控制系統(tǒng)可誘導(dǎo)正控制系統(tǒng)可阻遏負(fù)控制系統(tǒng)可阻遏正控制系統(tǒng)當(dāng)前第22頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第23頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)幾個(gè)概念：誘導(dǎo)物(inducer)：指當(dāng)作用于細(xì)胞群體時(shí),通過誘導(dǎo)機(jī)制、能增加特定基因轉(zhuǎn)錄的mRNA含量的一種化學(xué)因子或物理因子,輔阻遏物(corepressor)：一種能與阻遏蛋白形成功能阻遏物，而使合成代謝的操縱子受到阻遏的代謝終產(chǎn)物。

當(dāng)前第24頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)正調(diào)控與負(fù)調(diào)控并非互相排斥的兩種機(jī)制，而是生物體適應(yīng)環(huán)境的需要，有的系統(tǒng)既有正調(diào)控又有負(fù)調(diào)控；

原核生物以負(fù)調(diào)控為主，真核生物以正調(diào)控為主；

降解代謝途徑中既有正調(diào)控又有負(fù)調(diào)控；合成代謝途徑中一般以負(fù)調(diào)控來控制產(chǎn)物自身的合成。

當(dāng)前第25頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)可阻遏調(diào)節(jié)7.1.2原核基因表達(dá)調(diào)控的主要特點(diǎn)7.1.3弱化子對(duì)基因活性的影響7.1.4降解物對(duì)基因活性的影響7.1.5細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)當(dāng)前第26頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)1、DiscoveryofOperon

1961年,F.Jacob&J.Monod提出,此后不斷完善。獲1965年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)1940年，Monod發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時(shí)，細(xì)菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細(xì)菌的生長會(huì)出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生細(xì)胞中存在兩種酶，即組成酶與誘導(dǎo)酶1947年，報(bào)告：“酶的適應(yīng)現(xiàn)象及其在細(xì)胞分化中的意義”FrancisJacob

JacquesMonod

7.2乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)當(dāng)前第27頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)1951年，Monod與Jacob合作，發(fā)現(xiàn)兩對(duì)基因：Z基因：與合成β-半乳糖苷酶有關(guān)；I基因：決定細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)物的反應(yīng)。Szilard：I基因決定阻遏物的合成，當(dāng)阻遏物存在時(shí)，酶無法合成，只有有誘導(dǎo)物存在，才能去掉該阻遏物。

Jacob：結(jié)構(gòu)基因旁有開關(guān)基因（操縱基因），阻遏物通過與開關(guān)基因的結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。當(dāng)前第28頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)操縱子是一種完整的具有特定功能的細(xì)菌基因表達(dá)和調(diào)節(jié)的單位，包括調(diào)節(jié)基因，操縱位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)基因，組成一個(gè)控制單元。結(jié)構(gòu)基因：產(chǎn)生mRNA,合成蛋白質(zhì)操縱位點(diǎn)operator：啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白（與操縱位點(diǎn)結(jié)合）→結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物存在時(shí)，可與阻遏蛋白結(jié)合→結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄2、操縱子的定義當(dāng)前第29頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)7.2.1酶的誘導(dǎo)——lac體系受調(diào)控的證據(jù)當(dāng)前第30頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)菌對(duì)乳糖的利用及其相關(guān)的酶:

乳糖(在通透酶作用下進(jìn)入細(xì)菌）

β-半乳糖苷酶

別構(gòu)乳糖

β-半乳糖苷酶

葡萄糖+半乳糖

β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶當(dāng)前第31頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)1)lac操縱子的本底水平(basallevel)表達(dá)有兩個(gè)矛盾是操縱子理論所不能解釋的：①誘導(dǎo)物需要穿過細(xì)胞膜才能與阻遏物結(jié)合，而轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)物需要透過酶，后者的合成有需要誘導(dǎo)。②真正的誘導(dǎo)物是異構(gòu)乳糖而非乳糖，前者是在β-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有β-半乳糖甘酶的預(yù)先存在。一些誘導(dǎo)物可以在透過酶不存在時(shí)進(jìn)入細(xì)胞？一些透過酶可以在沒有誘導(dǎo)物的情況下合成？解釋：本底水平的組成型合成：非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量的lacmRNA合成。當(dāng)前第32頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)分解底物的酶只有在底物存在時(shí)才出現(xiàn)！無乳糖時(shí)，幾個(gè)b-gal/cell

加入乳糖時(shí)，5000個(gè)

乳糖的誘導(dǎo)作用是由酶前體轉(zhuǎn)化而來，還是誘導(dǎo)新酶合成？培養(yǎng)基（35S-aa,無乳糖）→E.coli繁殖→培養(yǎng)基（無35S-aa,加入乳糖）→β-gal(無35S)當(dāng)前第33頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)大腸桿菌對(duì)乳糖的反應(yīng)

培養(yǎng)基：甘油按照lac操縱子本底水平的表達(dá)，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)有幾個(gè)分子的β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷透過酶；培養(yǎng)基：加入乳糖少量乳糖透過酶進(jìn)入細(xì)胞β-半乳糖苷酶異構(gòu)乳糖誘導(dǎo)物誘導(dǎo)lacmRNA的生物合成大量乳糖進(jìn)入細(xì)胞多數(shù)被降解為葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）異構(gòu)乳糖當(dāng)前第34頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)乙?；D(zhuǎn)移酶半乳糖苷透性酶?-半乳糖苷酶操縱位點(diǎn)調(diào)節(jié)基因7.2.2lacOperon的模型及其影響因子當(dāng)前第35頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)Z編碼β-半乳糖苷酶：將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖Y編碼β-半乳糖苷透過酶：使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。A編碼β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶：乙酰輔酶A上的乙酰基轉(zhuǎn)到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。當(dāng)前第36頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)mRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol沒有乳糖存在時(shí)阻遏蛋白的調(diào)節(jié)阻遏基因1.乳糖操縱子調(diào)控模型當(dāng)前第37頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)mRNA阻遏蛋白有乳糖存在時(shí)IDNAZYAOPpol啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄mRNA乳糖別構(gòu)乳糖β-半乳糖苷酶當(dāng)前第38頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)（1）mRNA分子的啟動(dòng)子緊接著O區(qū)，而位于I與O之間的啟動(dòng)子區(qū)(P)，不能單獨(dú)起動(dòng)合成β-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。2.乳糖操縱子調(diào)控機(jī)制阻遏物lacI基因產(chǎn)物及功能

lac操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動(dòng)子控制下組成型合成的，每個(gè)細(xì)胞中有5-10個(gè)阻遏物分子。當(dāng)I基因由弱啟動(dòng)子突變成強(qiáng)啟動(dòng)子，細(xì)胞內(nèi)就不可能產(chǎn)生足夠的誘導(dǎo)物來克服阻遏狀態(tài)，整個(gè)lac操縱子在這些突變體中就不可誘導(dǎo)。當(dāng)前第39頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)RNA聚合酶結(jié)合部位阻遏物結(jié)合部位（2）操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)前第40頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)操縱位點(diǎn)的回文序列當(dāng)前第41頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)（3）當(dāng)阻遏物與操縱基因結(jié)合時(shí)，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。

當(dāng)前第42頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)（4）誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱基因結(jié)合，從而激發(fā)lacmRNA的合成。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動(dòng)子能夠順利起始mRNA的合成。當(dāng)前第43頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)阻遏蛋白單體的結(jié)構(gòu)阻遏蛋白單體的三級(jí)結(jié)構(gòu)當(dāng)前第44頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第45頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)乳糖（5）誘導(dǎo)物不是乳糖乳糖代謝生成lac誘導(dǎo)物Allolctose異構(gòu)乳糖別構(gòu)乳糖β-半乳糖苷酶當(dāng)前第46頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)IPTG，異丙基-β–D-硫代半乳糖苷TMG，巰甲基半乳糖苷ONPG,O-硝基半乳糖苷在研究誘導(dǎo)作用時(shí)，很少使用乳糖安慰誘導(dǎo)物(gratuitousinducer)：如果某種物質(zhì)能夠促使細(xì)菌產(chǎn)生酶而本身又不被分解，這種物質(zhì)被稱為安慰誘導(dǎo)物，如:當(dāng)前第47頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第48頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)α-complementation

lacZ△M15基因是缺失了編碼β-半乳糖苷酶中第11-41個(gè)氨基酸的lacZ基因，無酶學(xué)活性。對(duì)于只編碼N-端140個(gè)氨基酸的lacZ基因（稱為lacZ'），其產(chǎn)物也沒有酶學(xué)活性。但這兩個(gè)無酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)，可恢復(fù)

β-半乳糖苷酶的活性，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。在lacZ'

編碼區(qū)上游插入一小段DNA片段（如51個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)），不影響β-半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。但是，若在該DNA小片段中再插入一個(gè)片段，將幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無α-互補(bǔ)能力的β-半乳糖苷酶片段。利用這一互補(bǔ)性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZ△M15放在F質(zhì)粒上,隨宿主傳代；lacZ'放在載體上,作為篩選標(biāo)記。XL1-Blue菌株基因型：endA1gyrA96(nalR)thi-1recA1relA1lacglnV44F‘[Tn10proAB+lacIqΔ(lacZ)M15]hsdR17(rK-mK+)當(dāng)前第49頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)+glucose-glucoseTime(hr)Unitsofb-galactosidase+lactoseGlucoseadded（6）葡萄糖對(duì)lac操縱子的影響

代謝物阻遏效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，在Lac＋Glu培養(yǎng)基上

E.coli只利用G，只有G

耗盡時(shí)，才會(huì)利用lac葡萄糖抑制lacmRNA的轉(zhuǎn)錄：可阻止誘導(dǎo)物引起的阻遏物失活效應(yīng)，僅去掉阻遏物并不能啟動(dòng)lac基因表達(dá),有其它因素參與分解代謝阻遏(cataboliterepression)當(dāng)前第50頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)只有當(dāng)以乳糖為唯一碳源時(shí)，β-半乳糖苷酶的合成才增加。但是在以乳糖和葡萄糖為碳源時(shí)，如果加入cAMP，β-半乳糖苷酶的合成速率也會(huì)大大提高，可達(dá)到只用乳糖為碳源時(shí)的水平。這說明，cell內(nèi)cAMP的濃度能影響到β-半乳糖苷酶的合成速率。葡萄糖對(duì)lac操縱子表達(dá)的抑制是間接的當(dāng)前第51頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)ATP腺甘酸環(huán)化酶cAMP（環(huán)腺甘酸）

大腸桿菌中：無葡萄糖，cAMP濃度高；有葡萄糖，cAMP濃度低cAMP（環(huán)化腺苷一磷酸，cyclicAMP）1965年，B.Magasonik發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中也含有cAMP，而且菌株內(nèi)cAMP的含量常隨細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生變化，即當(dāng)細(xì)胞處于碳源饑餓條件下，cAMP水平顯著提高，反之．在細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中含有大量葡萄糖時(shí)，cAMP水平明顯降低；當(dāng)前第52頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)腺苷環(huán)化酶腺苷酸環(huán)化酶位于細(xì)胞膜上，其活性與葡萄糖運(yùn)輸?shù)拿赣嘘P(guān)，因此cAMP調(diào)控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等其他糖類代謝有關(guān)的酶。當(dāng)前第53頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第54頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

葡萄糖的降解是通過cAMP與CAP結(jié)合起作用。

CAP,cataboliteactivatorprotein，由crp編碼CRP,catabolitereceptorprotein代謝物激活蛋白（CAP）/環(huán)腺甘酸受體蛋白（CRP）CAP激活轉(zhuǎn)錄?（1）可能直接和RNAPol相互作用；

（2）作用于DNA，改變其結(jié)構(gòu)，從而幫助RNAPol結(jié)合。當(dāng)前第55頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)CAP結(jié)合位點(diǎn)CAP為二聚體，45KD，被cAMP激活結(jié)合位點(diǎn)～22bpI-70~-50II-50~-40當(dāng)前第56頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)CAP的結(jié)合對(duì)DNA構(gòu)型的影響DNA彎曲彎曲點(diǎn)位于CAP結(jié)合位點(diǎn)二重對(duì)稱的中心彎曲使CAP能與啟動(dòng)子上的RNApol接觸當(dāng)前第57頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)++++轉(zhuǎn)錄無葡萄糖，cAMP濃度高時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄有葡萄糖，cAMP濃度低時(shí)不促進(jìn)轉(zhuǎn)錄ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正調(diào)控當(dāng)前第58頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí)，CAP對(duì)該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用如無CAP存在，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合，操縱子仍無轉(zhuǎn)錄活性。cAMP—CAP復(fù)合物與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是轉(zhuǎn)錄起始所必需的。協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)葡萄糖對(duì)lac

操縱子的阻遏作用稱分解代謝阻遏(catabolicrepression)。

單純?nèi)樘谴嬖跁r(shí)，細(xì)菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在時(shí)，細(xì)菌首先利用葡萄糖。當(dāng)前第59頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)ZYAOPDNA

調(diào)控區(qū)CAP結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)序列操縱序列

結(jié)構(gòu)基因Z：β-半乳糖苷酶Y：通透酶A：乙?；D(zhuǎn)移酶cAMP—CAP復(fù)合物當(dāng)前第60頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)ThelacOperon:

WhenGlucoseIsPresentButNotLactoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveComeon,letmethroughNowayJose!CAP當(dāng)前第61頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)TheLacOperon:

WhenGlucoseAndLactoseArePresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveCAPLacRepressorRepressorXRNAPol.RNAPol.Great,Icantranscribe!Sometranscriptionoccurs,butataslowrateThislactosehasbentmeoutofshape當(dāng)前第62頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)ThelacOperon:

WhenLactoseIsPresentButNotGlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThislactosehasbentmeoutofshapeCAPcAMPCAPcAMPBindtomePolymeraseRNAPol.RNAPol.Yipee…!當(dāng)前第63頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)TheLacOperon:

WhenNeitherLactoseNorGlucoseIsPresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBindtomePolymeraseRNAPol.RepressorRepressormRNAHeyman,I’mconstitutiveRepressorSTOPRighttherePolymeraseAlright,I’mofftotheraces...Comeon,letmethrough!當(dāng)前第64頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)SummaryoflacoperonregulationGlucosecAMPLactoseTranscriptionoflacmRNAHighLowPresentlowrateofexpressionHighLowAbsentessentiallynoneLowHighAbsentessentiallynoneLowHighPresenthighrateofexpression當(dāng)前第65頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)lacoperon的其它問題lacoperon的功能是在正負(fù)兩個(gè)調(diào)控體系的協(xié)調(diào)作用(coordinateregulation)下實(shí)現(xiàn)的。阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí)，CAP不發(fā)揮作用；如沒有CAP加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，即使阻遏蛋白從P上解聚仍無轉(zhuǎn)錄活性CAP組成型合成，所以cAMP－CAP復(fù)合物取決于cAMP含量腺苷酸環(huán)化酶位于細(xì)胞膜上，其活性與葡萄糖運(yùn)輸?shù)拿赣嘘P(guān)，因此cAMP－CAP調(diào)控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖類代謝有關(guān)的酶降解物敏感型操縱子：只要有葡萄糖存在，這些操縱子就不表達(dá)當(dāng)前第66頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)2.A基因及其生理功能編碼b-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶，使半乳糖苷乙?；Ｔ撁覆粎⑴c乳糖代謝！生理意義：在細(xì)胞中有許多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷類物質(zhì)，其分解產(chǎn)物不能進(jìn)一步代謝，積累，抑制細(xì)胞生長。半乳糖苷乙酰化后，即無毒.所以lacA雖不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物質(zhì)的積累3.lac基因產(chǎn)物數(shù)量，1：0.5：0.2

不同酶的數(shù)量差異,是由于在翻譯水平上的調(diào)節(jié).方式有二：核糖體脫離；多順反子的差別性翻譯

內(nèi)切酶作用:在lacmRNA分子內(nèi)部，a基因比z基因更易受內(nèi)切酶作用當(dāng)前第67頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)總結(jié)---乳糖操縱子的作用機(jī)制1、乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O，一個(gè)啟動(dòng)子P和一個(gè)調(diào)節(jié)基因I。2、阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：沒有乳糖存在時(shí)，I基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時(shí)，乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導(dǎo)開放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控。當(dāng)前第68頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)3、CAP的正調(diào)節(jié)：在啟動(dòng)子上游有CAP結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時(shí)，cAMP濃度升高，與CAP結(jié)合，使CAP發(fā)生變構(gòu)，CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動(dòng)序列附近的CAP結(jié)合位點(diǎn)，激活RNA聚合酶活性，促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)乳糖操縱子實(shí)行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。4、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機(jī)制，互相協(xié)調(diào)、互相制約?？偨Y(jié)---乳糖操縱子的作用機(jī)制當(dāng)前第69頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)7.4其他操縱子

GalactoseOperon

ArabinoseOperon當(dāng)前第70頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)半乳糖操縱子大腸桿菌半乳糖操縱子(galactoseoperon)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：

異構(gòu)酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)，半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶(galactosetransferase,galT)半乳糖激酶(galactosekinase,galk)。

當(dāng)前第71頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)MapoftheE.coligaloperonandnucleotidesequenceoftheregulatoryregion3個(gè)酶的作用：使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。galR與galE、T、K及操縱區(qū)O等離得很遠(yuǎn)，而galR產(chǎn)物對(duì)galO的作用與lacI-lacO的作用相同。當(dāng)前第72頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)gal操縱子的特點(diǎn)：①它有兩個(gè)啟動(dòng)子，其mRNA可從兩個(gè)不同的起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄；②它有兩個(gè)O區(qū)，一個(gè)在P區(qū)上游-67--53，另一個(gè)在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。CAP,cataboliteactivatorprotein，由crp編碼CRP,catabolitereceptorprotein代謝物激活蛋白（CAP）/環(huán)腺甘酸受體蛋白（CRP）當(dāng)前第73頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)因?yàn)榘肴樘堑睦眯时绕咸烟堑停藗儾孪肫咸烟谴嬖跁r(shí)半乳糖操縱子不被誘導(dǎo)，但實(shí)際上有葡萄糖存在時(shí)，gal操縱子仍可被誘導(dǎo)?，F(xiàn)已分離到一些突變株，其中一類突變株能在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中高水平合成半乳糖代謝酶類（gal結(jié)構(gòu)基因高效表達(dá)）；而另一類突變株中g(shù)al基因的表達(dá)完全依賴于葡萄糖，培養(yǎng)基中如無葡萄糖存在，這些細(xì)菌的gal基因不表達(dá)，不合成半乳糖代謝酶類。當(dāng)前第74頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)分析gal操縱子P-O區(qū)的DNA序列發(fā)現(xiàn)，該操縱子確實(shí)存在兩個(gè)相距僅5bp的啟動(dòng)子，可以分別起始mRNA的合成。每個(gè)啟動(dòng)子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)S1和S2。從S1起始的轉(zhuǎn)錄只有在培養(yǎng)基中無葡萄糖時(shí)，才能順利進(jìn)行，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖、CAP和較高濃度的cAMP。從S2起始的轉(zhuǎn)錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由這個(gè)啟動(dòng)子起始的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有cAMP-CAP時(shí)，轉(zhuǎn)錄從S1開始，當(dāng)無cAMP-CAP時(shí)，轉(zhuǎn)錄從S2開始。1.cAMP-CRP對(duì)gal啟動(dòng)子的作用當(dāng)前第75頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)為什么gal操縱子需要兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)？半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細(xì)胞生長，而且與之相關(guān)的物質(zhì)--尿苷二磷酸半乳糖（UDP-gal）是大腸桿菌細(xì)胞壁合成的前體。在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖差向異構(gòu)酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，該酶是galE基因的產(chǎn)物。異構(gòu)酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)，當(dāng)前第76頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)生長過程中的所有時(shí)間里細(xì)胞必須能夠合成差向異構(gòu)酶。現(xiàn)在設(shè)想只有S1一個(gè)啟動(dòng)子，那么由于這個(gè)啟動(dòng)子的活性依賴于cAMP-CRP，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時(shí)就有能合成異構(gòu)酶。假如唯一的啟動(dòng)子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情況下，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導(dǎo)狀態(tài)，這無疑是一種浪費(fèi)。無論從必要性或經(jīng)濟(jì)性考慮，都需要一個(gè)不依賴于cAMP-CAP的啟動(dòng)子（S1）對(duì)高水平合成進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)前第77頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

在E.coli中阿拉伯糖的降解需要3個(gè)基因：araB、araA和araD，形成一個(gè)基因簇，簡寫為araBAD

分別編碼阿拉伯糖代謝需要的三種酶：核酮糖激酶（ribulosekinase），阿拉伯糖異構(gòu)酶（arabinoseisomerase）核酮糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶(ribulose-5-phosphateeimerase)7.4.2阿拉伯糖操縱子當(dāng)前第78頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)araBAD和araC基因的轉(zhuǎn)錄是以相反的方向進(jìn)行的。在標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)圖譜上，araBAD基因簇從啟動(dòng)子PBAD開始向右進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而araC基因則是從Pc向左轉(zhuǎn)錄。復(fù)合啟動(dòng)子區(qū)主要有：1、PBAD區(qū)：AraBAD啟動(dòng)子區(qū)2、araC位點(diǎn)：C蛋白·阿拉伯糖復(fù)合物與操縱子結(jié)合區(qū)3、-280區(qū)：是C蛋白與操縱子結(jié)合區(qū)當(dāng)前第79頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)結(jié)構(gòu):具有正負(fù)調(diào)節(jié)功能的操縱子與araB、araA和araD這3結(jié)構(gòu)基因相鄰的是一個(gè)復(fù)合啟動(dòng)子區(qū)和一個(gè)調(diào)節(jié)基因C，由調(diào)節(jié)基因C合成的AraC蛋白是一個(gè)自我調(diào)節(jié)蛋白(autoregulatedprotein)，它既是ara操縱子的正調(diào)節(jié)蛋白，又是ara操縱子的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白。當(dāng)前第80頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)1.阿拉伯糖操縱子的調(diào)節(jié)機(jī)制當(dāng)前第81頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第82頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)ara操縱子的調(diào)控有三個(gè)特點(diǎn)：第一，araC表達(dá)受到AraC的自動(dòng)調(diào)控。第二，AraC既可充當(dāng)阻遏物，也可作為激活劑。第三，AraC與CAP結(jié)合可充分誘導(dǎo)ara操縱子。

當(dāng)前第83頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

AraC蛋白作為PBAD活性正、負(fù)調(diào)節(jié)因子的雙重功能是通過該蛋白的兩種異構(gòu)體來實(shí)現(xiàn)的。Pr是起阻遏作用的形式，而Pi是起誘導(dǎo)作用的形式，它通過與PBAD啟動(dòng)子結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)。在沒有阿拉伯糖時(shí)，Pr形式占優(yōu)勢(shì)；一旦有阿拉伯糖存在，它就能夠與AraC蛋白結(jié)合，使平衡趨向于Pi形式。這樣，阿拉伯糖的誘導(dǎo)作用就可以解釋為阿拉伯糖與Pr的結(jié)合，使Pr離開它的結(jié)合位點(diǎn)，然后，產(chǎn)生大量的Pi，并與啟動(dòng)子結(jié)合。當(dāng)前第84頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含有葡萄糖，所以cAMP-CAP沒有與操縱區(qū)位點(diǎn)相結(jié)合，AraC蛋白處于Pr形式并與A位點(diǎn)結(jié)合，RNA聚合酶很少再與Pc結(jié)合，araC基因雖然仍有轉(zhuǎn)錄，但受到抑制，只有少量AraC蛋白形成，整個(gè)系統(tǒng)幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)。沒有葡萄糖，也沒有阿拉伯糖，因?yàn)闆]有誘導(dǎo)物，盡管有cAMP-CAP與操縱區(qū)位點(diǎn)相結(jié)合，AraC蛋白仍以Pr形式為主，無法與操縱區(qū)B位點(diǎn)相結(jié)合，無araBADmRNA轉(zhuǎn)錄。無葡萄糖，有阿拉伯糖時(shí)，大量araC基因產(chǎn)物以Pi形式存在，并分別與操縱區(qū)B、A位點(diǎn)相結(jié)合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表達(dá)，操縱子充分激活。當(dāng)前第85頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)araC的表達(dá)受到自身產(chǎn)物AraC的自動(dòng)調(diào)控。當(dāng)沒有阿拉伯糖時(shí)，AraC起著一個(gè)轉(zhuǎn)錄阻遏物的作用。細(xì)胞中AraC蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)水平的測(cè)量表明，阻遏araC轉(zhuǎn)錄大約需要40個(gè)AraC。因此當(dāng)AraC蛋白水平低時(shí)(就是說在細(xì)胞剛分裂之后)，araC將表達(dá)直至存在足夠的AraC去阻遏它的轉(zhuǎn)錄。

2.阿拉伯糖操縱子的自主調(diào)節(jié)當(dāng)前第86頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)阿拉伯糖的作用象AraC的一個(gè)調(diào)控器，可將AraC由一個(gè)阻遏物轉(zhuǎn)換為一個(gè)激活劑。阿拉伯糖與AraC結(jié)合似乎改變了AraC同源二聚體化特性和促進(jìn)了AraC-CAP復(fù)合物的形成。在這樣的條件下，AraC－阿拉伯糖的作用象是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活劑，這正是CAP-cAMP誘導(dǎo)araB，araA，araD轉(zhuǎn)錄所需要的。當(dāng)前第87頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)由于araBAD編碼的蛋白質(zhì)的代謝使得阿拉伯糖水平下降時(shí)，AraC又轉(zhuǎn)換成一個(gè)阻遏物，同時(shí)araBAD轉(zhuǎn)錄減少，此時(shí)盡管CAP-cAMP復(fù)合物仍然存在于細(xì)胞中。有趣的是，當(dāng)葡萄糖和阿拉伯糖都很豐富時(shí)，ara操縱子被阻遏，這個(gè)結(jié)果表明araBAD誘導(dǎo)與AraC-阿拉伯糖和CAP-cAMP復(fù)合物都有關(guān)。當(dāng)前第88頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第89頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)7.3trpoperon與負(fù)調(diào)控阻遏系統(tǒng)當(dāng)前第90頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

lac,

gal和ara操縱子是編碼分解代謝途徑酶系的操縱子，負(fù)責(zé)碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，這些操縱子的表達(dá)受相應(yīng)碳源的誘導(dǎo)。在細(xì)菌中還有負(fù)責(zé)一些物質(zhì)合成代謝的操縱子，例如色氨酸操縱子（tryptophanoperon,trpoperon）就是負(fù)責(zé)色氨酸合成的操縱子。當(dāng)前第91頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)Trpoperon生物細(xì)胞中的氨基酸合成，也受操縱子的調(diào)節(jié)。細(xì)胞需要某種氨基酸時(shí)，其基因即表達(dá)，不需要時(shí)基因關(guān)閉，達(dá)到經(jīng)濟(jì)的原則。當(dāng)前第92頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

由于trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的調(diào)控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7個(gè)基因參與整個(gè)合成過程。trpE和trpG編碼鄰氨基苯甲酸合酶，trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，trpF編碼異構(gòu)酶，trpC編碼吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB則分別編碼色氨酸合酶的α和β亞基。一、色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)當(dāng)前第93頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)催化分枝酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼岬拿敢?、色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn):(1)trpR和trpABCDE不連鎖；

(2)操縱基因在啟動(dòng)子內(nèi)

(3)有衰減子(attenuator)/弱化子

(4)啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因不直接相連，二者被前導(dǎo)序列(Leader)所隔開當(dāng)前第94頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)trpoperon的阻遏系統(tǒng)TrpR四聚體當(dāng)前第95頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)阻遏蛋白＋trp

→有活性的阻遏物SNE299＋trpO→不轉(zhuǎn)錄當(dāng)前第96頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)2阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)trpO-21~+1，反向重復(fù)序列trpP-40~+18活性阻遏物與trpO的結(jié)合與RNApol與啟動(dòng)子的結(jié)合發(fā)生競(jìng)爭當(dāng)前第97頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)3阻遏系統(tǒng)主管轉(zhuǎn)錄是否啟動(dòng)，低濃度Trp時(shí)，mRNA起始合成

粗調(diào)開關(guān)當(dāng)前第98頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)3阻遏系統(tǒng)在trpmRNA5‘端trpE基因的起始密碼前有一個(gè)長162bp的mRNA片段，如果其中123～150位堿基序列缺失，trp基因表達(dá)可提高6-10倍，而且無論是在阻遏細(xì)胞內(nèi)還是在永久性突變的細(xì)胞內(nèi)都一樣。當(dāng)mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉(zhuǎn)錄總是在這個(gè)區(qū)域終止，產(chǎn)生一個(gè)僅有140個(gè)核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉(zhuǎn)錄。162bp的片段----前導(dǎo)區(qū)123～150區(qū)序列----弱化子終止的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)域稱為弱化子(衰減子)當(dāng)前第99頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)1）弱化子：

DNA中可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過早終止的一段核甘酸序列（123-150區(qū)）。123~150當(dāng)前第100頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)實(shí)驗(yàn)表明弱化作用需要負(fù)載tRNATrp參與，意味著前導(dǎo)序列的某些部分被翻譯了。分析前導(dǎo)序列發(fā)現(xiàn)，它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA；如果翻譯起始于AUG，應(yīng)該產(chǎn)生一個(gè)含有14個(gè)氨基酸的多肽。這個(gè)假設(shè)的多肽（實(shí)際未觀察到）稱為前導(dǎo)肽。當(dāng)前第101頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)前導(dǎo)序列具有一個(gè)非常有意義的特點(diǎn)，在其第10和第11位上有相鄰的兩個(gè)色氨酸密碼子。組氨酸操縱子中，也具有弱化子，也具有一個(gè)類似的能編碼前導(dǎo)肽的堿基序列，此序列中含有7個(gè)相鄰的組氨酸密碼子。苯丙氨酸操縱子中同樣存在弱化子結(jié)構(gòu)，其前導(dǎo)序列中也有7個(gè)苯丙氨酸密碼子。這些密碼子參與了trp及其他操縱子的轉(zhuǎn)錄弱化機(jī)制。當(dāng)前第102頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第103頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)

POE4321LDNARNAATGTGA2trpcodons1432mRNA前導(dǎo)區(qū)的序列分析

trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測(cè)定，引人注目的是其中4個(gè)分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對(duì)，有時(shí)以1-2和3-4配對(duì)，有時(shí)只以2-3方式互補(bǔ)配對(duì)。RNaseT1降解實(shí)驗(yàn)（此酶不能水解配對(duì)的RNA）表明，純化的trp前導(dǎo)序列中確有1-2和3-4的配對(duì)方式，由此定位的3-4配對(duì)區(qū)正好位于終止密碼子的識(shí)別區(qū)，當(dāng)這個(gè)區(qū)域發(fā)生破壞自我配對(duì)的堿基突變時(shí)有利于轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)進(jìn)行。當(dāng)前第104頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)UUUU……UUUU……調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)構(gòu)基因trpROP前導(dǎo)序列弱化子區(qū)域UUUU……前導(dǎo)mRNA1234弱化子結(jié)構(gòu)第10、11密碼子為trp密碼子終止密碼子14aa前導(dǎo)肽編碼區(qū):

包含序列1形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)能力強(qiáng)弱：序列1/2>序列2/3>序列3/4

trp密碼子UUUU……當(dāng)前第105頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)Terminator

研究引起終止的mRNA堿基序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)mRNA通過自我配對(duì)可以形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，有典型的終止子特點(diǎn)。當(dāng)前第106頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)UUUU……34UUUU3’34核糖體前導(dǎo)肽前導(dǎo)mRNA1.當(dāng)色氨酸濃度高時(shí)轉(zhuǎn)錄衰減機(jī)制125’trp密碼子弱化子結(jié)構(gòu)就是終止子可使轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)DNAUUUU3’RNA聚合酶終止當(dāng)前第107頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)UUUU……342423UUUU……核糖體前導(dǎo)肽前導(dǎo)mRNA15’trp密碼子

結(jié)構(gòu)基因前導(dǎo)DNARNA聚合酶2.當(dāng)色氨酸濃度低時(shí)Trp合成酶系相關(guān)結(jié)構(gòu)基因被轉(zhuǎn)錄序列3、4不能形成弱化子結(jié)構(gòu)當(dāng)前第108頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)弱化子對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵空間結(jié)構(gòu)，10thand11thcodonsencodethetrpresidues(rareAA)時(shí)間，核糖體停頓在2個(gè)Trp密碼子上時(shí)，產(chǎn)生延宕(delay

)，此時(shí)4區(qū)未轉(zhuǎn)錄出來Theleaderpeptideistodeterminertrpavailabilityandtoregulatetranscriptiontermination14–amino-acid(encodedby27-68oftheleaderRNAsummary當(dāng)前第109頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)trpOperon:阻遏作用與弱化作用的協(xié)調(diào)trp操縱子具有雙重調(diào)節(jié)體系細(xì)菌通過弱化作用彌補(bǔ)阻遏作用的不足，因?yàn)樽瓒糇饔弥荒苁罐D(zhuǎn)錄不起始，對(duì)于已經(jīng)起始的轉(zhuǎn)錄，只能通過弱化作用使之中途停下來。阻遏作用的信號(hào)是細(xì)胞內(nèi)色氨酸的多少；弱化作用的信號(hào)則是細(xì)胞內(nèi)載有色氨酸的tRNA的多少。它通過前導(dǎo)肽的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)這兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生物體內(nèi)周密的調(diào)控作用。當(dāng)前第110頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)Negative—repressibleoperon可以被最終合成產(chǎn)物所阻遏RPOleadingseq.EDCBAtrp+為什么需要阻遏體系？當(dāng)大量Trp存在時(shí)，阻遏系統(tǒng)起作用。阻遏物與之結(jié)合，阻止先導(dǎo)mRNA合成。

經(jīng)濟(jì)當(dāng)前第111頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)僅有少量trp時(shí)，RNApol啟動(dòng)RPOleadingseq.EDCBA少量trp+不足以結(jié)合

O

位點(diǎn)，弱化子不起作用為什么需要弱化系統(tǒng)？當(dāng)Trp濃度低時(shí)，阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)腡rp水平。當(dāng)前第112頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)菌演化出弱化系統(tǒng)的生物學(xué)意義

通過tRNA荷載與否進(jìn)行調(diào)控，更為靈敏氨基酸的主要用途是合成蛋白質(zhì)，因而tRNA荷載為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)控更為恰當(dāng)兩個(gè)調(diào)控系統(tǒng)，避免浪費(fèi)提高效率阻遏系統(tǒng)高水平trp時(shí)，不轉(zhuǎn)錄低水平trp時(shí)，轉(zhuǎn)錄至滿足生長需求

弱化系統(tǒng)細(xì)調(diào)原核生物細(xì)致的精細(xì)調(diào)控機(jī)制增強(qiáng)原核生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性當(dāng)前第113頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)在負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的作用。根據(jù)其作用特征又可分為負(fù)控誘導(dǎo)和負(fù)控阻遏：在負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄；在負(fù)控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白輔阻遏物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。原核基因調(diào)控機(jī)制的類型總結(jié)當(dāng)前第114頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)負(fù)控誘導(dǎo)在負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第115頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)負(fù)控阻遏在負(fù)控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與輔阻遏物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第116頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。根據(jù)激活蛋白的作用性質(zhì)分為正控誘導(dǎo)和正控阻遏：在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，誘導(dǎo)物的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；在正控阻遏系統(tǒng)中，輔阻遏物的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。當(dāng)前第117頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)正控誘導(dǎo)在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子(誘導(dǎo)物)的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；當(dāng)前第118頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)正控阻遏在正控阻遏系統(tǒng)中，輔阻遏物的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。當(dāng)前第119頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)當(dāng)前第120頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)7.4.3阻遏蛋白LexA的降解與細(xì)胞中的SOS應(yīng)答AnoverviewoftheSOSresponseinE.coli.當(dāng)前第121頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)7.4.3阻遏蛋白LexA的降解與細(xì)胞中的SOS應(yīng)答AnoverviewoftheSOSresponseinE.coli.當(dāng)前第122頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)7.4.4二組分調(diào)控系統(tǒng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

7.4.5受多啟動(dòng)子調(diào)控的操縱子

當(dāng)前第123頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)操縱子的融合與基因工程POZYA結(jié)構(gòu)基因缺失lacoperon結(jié)構(gòu)基因I當(dāng)前第124頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)IPTG，異丙基-β–D-硫代半乳糖苷TMG，巰甲基半乳糖苷ONPG,O-硝基半乳糖苷在研究誘導(dǎo)作用時(shí)，很少使用乳糖安慰誘導(dǎo)物(gratuitousinducer)：如果某種物質(zhì)能夠促使細(xì)菌產(chǎn)生酶而本身又不被分解，這種物質(zhì)被稱為安慰誘導(dǎo)物，如:當(dāng)前第125頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第126頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)10.11重疊基因的調(diào)控作用重疊基因最早在大腸桿菌噬菌體ΦX174中發(fā)現(xiàn)，用不同的閱讀方式得到不同的蛋白質(zhì)，絲狀RNA噬菌體、線粒體DNA和細(xì)菌染色體上都有重疊基因存在。當(dāng)前第127頁\共有140頁\編于星期四\21點(diǎn)TrpB–谷氨酸-異亮氨酸-終止

GAA--AUC--UGA

--UGG--AA