椎間盤退變動物模型研究進展

椎間盤退變動物模型研究進展

【關(guān)鍵詞】椎間盤退變

常用于研究椎間盤退變(intervertebraldiscdegeneration，IVDD)的發(fā)生機制和檢測介入治療手段有效性的動物實驗?zāi)Ｐ涂煞譃轶w內(nèi)、體外和計算機模擬實驗三種。體外實驗?zāi)Ｐ秃陀嬎銠C模擬實驗?zāi)Ｐ脱芯縄VDD有明顯的局限性，所以常用的實驗方法仍然是體內(nèi)研究。體內(nèi)椎間盤退變模型可分為自發(fā)性和誘導(dǎo)性兩種。自發(fā)性椎間盤退變模型是通過系統(tǒng)方法引起動物遺傳改變，或通過改變喂養(yǎng)食物引起動物行為方式改變而引起IVDD發(fā)生。誘導(dǎo)性椎間盤退變模型又可分為機械性損害模型和結(jié)構(gòu)性損害模型。為了更好地了解各種動物模型的優(yōu)缺點，本文對椎間盤退變動物模型進行了比較，分析其與人類可能的相關(guān)性。

1動物模型的要求及動物選擇

關(guān)于IVDD動物模型的方法已經(jīng)有多種報道，所選擇的動物和方法的可靠性、可重復(fù)性亦存在較大差異［1］。建立的動物模型要求與人類的IVDD具有相似性和可比擬性。應(yīng)包括以下幾個方面：a)能再現(xiàn)椎間盤退行性病變的客觀規(guī)律；b)模型重復(fù)性好；c)所選的動物解剖和生理特點盡可能與人類近似。動物模型制備已經(jīng)有近75年的歷史。Lob等(1933)損傷兔的纖維環(huán)后觀察到椎間盤產(chǎn)生與人類椎間關(guān)節(jié)病相似變化。Key等(1948)首先報道實驗動物椎間盤退行性改變。靈長類在生物進化方面同人類的親緣關(guān)系比較密切，解剖生理特點與人類最為近似，如恒河猴是用于制作人椎間盤退變模型最為理想的動物，但是由于經(jīng)濟因素，其應(yīng)用受到一定限制。近十幾年來，傾向于選用豬、狗、羊等傳統(tǒng)動物制作模型。目前大鼠是最常用的實驗動物，具有價格低廉，飼養(yǎng)方便，可適用大規(guī)模實驗等優(yōu)點，而且其椎間盤在解剖和生化結(jié)構(gòu)上與人類椎間盤非常相似［2］。

2椎間盤退變動物模型的建立

誘發(fā)性椎間盤退變模型

機械模型

應(yīng)力改變致椎間盤退變模型流行病學(xué)研究顯示IVDD與應(yīng)力有關(guān)。生物力學(xué)因素在IVDD中的作用非常突出，首先異常的應(yīng)力可直接損傷椎間盤結(jié)構(gòu)。Kuga等［3］用兩歲大鼠(相當于20～40歲的人)椎單位進行疲勞應(yīng)力試驗發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)易于發(fā)生破裂，有時可伴軟骨終板破裂，顯示椎間盤突出是纖維環(huán)破裂引起，而與髓核無關(guān)。然而，更重要的是力學(xué)因素可通過影響椎間盤組織的生物學(xué)特性而引起進一步作用，導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)性能改變及其細胞合成分泌代謝紊亂。VanDeursen等［4］發(fā)現(xiàn)在持續(xù)壓應(yīng)力作用下，牛椎間盤髓核發(fā)生蠕變，應(yīng)力下降，而纖維環(huán)應(yīng)力增高。Chiu等［5］通過MRI發(fā)現(xiàn)，在壓應(yīng)力下椎間盤髓核的脫水程度明顯大于纖維環(huán)。陳立等［6］實驗研究表明，正常力學(xué)環(huán)境下，增齡因素對軟骨終板蛋白聚糖(proteoglycan，PG)代謝影響較小，PG各組分含量保持相對穩(wěn)定。而異常生物力學(xué)環(huán)境可直接導(dǎo)致終板PG含量不斷減少和成分比例改變。為了闡明和理解脊柱受力與椎間盤退變之間的關(guān)系，許多研究者通過施加軸向壓力［7］和張力［8］來建立椎間盤退變動物模型。Lindblom等首次利用彎曲鼠尾的方法建立椎間盤退變模型后，有很多人用該法作實驗。Lotz等［9］將大鼠的尾巴屈曲固定，觀察屈曲側(cè)椎間盤的退變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)椎間盤損害程度與屈曲的區(qū)間有關(guān)。由此推斷椎間盤退變可能是一種椎間盤細胞的壓迫性萎縮。Sarver等［10］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠尾巴椎間盤比腰椎椎間盤有更大的過渡區(qū)，以致有更好的彈性力和粘彈性力。早期對IVDD的研究主要是通過兩足鼠完成，因為兩足鼠腰椎承受一定的重力，隨著年齡增加，腰椎退變加速，神經(jīng)核脊索細胞在早期即被纖維軟骨細胞替代，引起IVDD。吳靖平等［11］用雙后肢普通大鼠建立椎間盤退變動物模型。在實驗中發(fā)現(xiàn)，正常老年大鼠髓核中脊索細胞隨年齡的增長而逐漸發(fā)生退變，雙后肢大鼠的退變更嚴重，髓核細胞的這種退變與人類椎間盤細胞的退變規(guī)律完全一致。截肢法是因為改變脊柱的生物力學(xué)致腰椎椎間盤承受較大壓力而發(fā)生退變。人類椎間盤承受重力是導(dǎo)致椎間盤退變的因素之一。故本法所致IVDD的原因和發(fā)展規(guī)律與人類IVDD有相似，因此不僅適用于進行椎間盤和脊柱退行性疾病的研究，還可以對椎間盤摘除、脊柱融合、椎間盤移植等各種手術(shù)引起的變化進行系統(tǒng)的研究，是一種比較經(jīng)濟實用、簡單科學(xué)的直立動物模型，但它只能適用于小型動物。

脊柱運動節(jié)段不穩(wěn)致椎間盤退變模型采用手術(shù)破壞脊柱的一些支持組織(如小關(guān)節(jié)［12］、棘突等)、一定頻率和一定時間內(nèi)反復(fù)刺激脊柱周圍的肌肉［13］、椎體內(nèi)固定和椎間關(guān)節(jié)融合［14］等手段可使脊柱過度運動，產(chǎn)生脊柱不穩(wěn)。研究證明，椎間盤過度反復(fù)運動可促發(fā)椎間盤退變，如纖維環(huán)分層破壞、細胞組織變形和凋亡、骨贅形成等。運動干擾早期，纖維環(huán)周圍細胞增殖并分化為類軟骨細胞。如果刺激持續(xù)存在，軟骨增殖使椎體邊緣骨贅增生，堿性成纖維細胞生長因子表達增加。相對于壓迫模型，不穩(wěn)定模型的應(yīng)力和細胞效應(yīng)主要通過纖維環(huán)在腰椎屈曲產(chǎn)生，髓核主要是作為一個支點發(fā)揮作用。脊柱運動節(jié)段不穩(wěn)定模型提示，超過生理范圍的運動可加速椎間盤由外向內(nèi)退變，椎間盤周圍的高應(yīng)力可刺激椎體周邊骨贅形成和重塑。這些變化不同于壓力模型產(chǎn)生高壓力導(dǎo)致椎間盤由內(nèi)向外的改變，但是長期不穩(wěn)和長期壓力作用對椎間盤最終產(chǎn)生共同的作用途徑。

結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)模型分為直接造成椎間盤損傷動物模型和化學(xué)方法致椎間盤退變動物模型兩種。直接造成椎間盤損傷動物模型的常用制模方法是通過穿刺造成纖維環(huán)和終板損傷，引起急性椎間盤突出和髓核壓力降低，啟動椎間盤突變的級鏈反應(yīng)。

纖維環(huán)損傷法Key等(1948)首先應(yīng)用損傷實驗動物后制作動物模型的方法，此后被廣泛采用和改進。Osti等［15］將羊的前外側(cè)纖維環(huán)部分切開建立動物模型，并認為在保證纖維環(huán)內(nèi)層未受到損傷的情況下，僅纖維環(huán)的外層損傷依然能導(dǎo)致IVDD。IVDD是一種由外而內(nèi)的過程，纖維環(huán)的外層損傷在椎間盤的退變過程中具有重要作用。纖維環(huán)損傷按部位分為：前部正中、前外側(cè)、后部正中及后外側(cè)損傷；根據(jù)損傷方式分為：刀割裂傷、纖維環(huán)開窗術(shù)、針刺傷和刮擦傷。損傷可分為纖維環(huán)的部分或全層，可在椎間盤的中央也可鄰近上位或下位終板。Anderson等［16］和呂浩然等［17］用前側(cè)纖維環(huán)切開法來研究正常和退變椎間盤中基因表達的實驗，同樣證實了該方法的可行性。與后側(cè)纖維環(huán)切開法相比，前側(cè)纖維環(huán)切開法具有不破壞脊柱穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，操作更為簡便的優(yōu)點，但卻存在手術(shù)創(chuàng)傷大，術(shù)后動物難于存活的缺點。Nguyen等［18］應(yīng)用髓核抽吸技術(shù)，在X線透視下經(jīng)后外側(cè)入路，對后外側(cè)纖維環(huán)行纖維環(huán)切開及髓核物質(zhì)的抽吸，制作了狗的椎間盤退變模型。Lipson等［19］對兔纖維環(huán)的前部刮擦傷后，在一定時間內(nèi)對椎間盤的生物化學(xué)改變進行觀察，未發(fā)現(xiàn)異常變化。兔模型椎間盤用11號刀片損傷后很快出現(xiàn)髓核容量喪失，1周內(nèi)即可引起髓核或纖維環(huán)邊緣明顯變化，1個月即可出現(xiàn)髓核的纖維替代，36周可出現(xiàn)纖維環(huán)裂口形成和細胞構(gòu)成丟失。以上方法均需形體較大的動物，雖然其創(chuàng)傷小，但由于引起退變所需標準、針刺深度不易掌握，容易造成髓核急性突出，目前很少采用通過穿刺方法制作動物模型。

軟骨終板損傷法該法通過椎體鉆一斜行的孔洞直達軟骨終板和髓核來制作椎間盤退變模型，急性終板損傷引起髓核壓力降低和應(yīng)力重新分布，從而導(dǎo)致椎間盤退變。Holm等［20］用該法成功建立椎間盤退變模型。但其破壞終板程度不易掌握，損傷后可立即出現(xiàn)一些變化，如Schmorl結(jié)節(jié)、局部出血及續(xù)發(fā)周圍肉芽組織形成等而影響觀察。此法創(chuàng)傷較大，有一定死亡率，目前很少用。

化學(xué)方法致椎間盤退變動物模型髓核化學(xué)溶解術(shù)的原理即是通過選擇性破壞蛋白多糖以減少椎間盤體積，從而解除椎間盤對相鄰神經(jīng)根的壓迫和刺激。這種治療已通過在兔或犬的椎間盤內(nèi)注射木瓜凝乳蛋白酶得到證明，該酶主要作用于髓核中連接長鏈粘多糖的非膠原蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)發(fā)生去集合作用，釋放出硫酸軟骨素，致使髓核中蛋白質(zhì)的分子量和粘稠度下降，而對纖維環(huán)不發(fā)生作用。適當劑量的木瓜凝乳蛋白酶可導(dǎo)致蛋白快速丟失，椎間盤體積減小，其生物力學(xué)發(fā)生改變。在治療后早期，纖維環(huán)層狀排列變得松弛，細胞塌陷。經(jīng)過一段長期過程后，髓核的蛋白多糖逐漸恢復(fù)，直到接近正常的含量和組成。然而，大劑量木瓜凝乳蛋白酶可能因為固有的蛋白水解作用而引起更加廣泛的椎間盤損害，所以在試驗過程和臨床治療中須選擇理想的治療劑量［21］。由于木瓜凝乳蛋白酶的毒性和缺乏基質(zhì)的特異性，其退變與人類椎間盤退變過程有差別，因此該模型可靠性較差?，F(xiàn)在正在對軟骨素酶ABC(CABC)的作用進行評估。CABC對纖維環(huán)和髓核可產(chǎn)生不同的作用效果，并可能與白介素1共同作用于纖維軟骨細胞產(chǎn)生的膠原酶。與木瓜凝乳蛋白酶的作用相似，CABC可引起髓核細胞早期丟失、膠原蛋白容量減少、生物力學(xué)功能障礙［22］。近年有研究［23］發(fā)現(xiàn)纖維連接蛋白對人椎間盤退變產(chǎn)生重大影響，其間斷注射至兔腰椎間盤內(nèi)可產(chǎn)生生理退變性動物模型。與髓核化學(xué)溶解術(shù)一樣，纖維連接蛋白間斷注射早期即影響髓核的細胞質(zhì)和基質(zhì)。然而，這些變化較髓核化學(xué)溶解術(shù)引起的變化更激進，并且不會經(jīng)過一段時間后得到恢復(fù)。最后髓核被纖維組織替代，纖維環(huán)疊層之間出現(xiàn)裂口，外圍骨贅形成，整個改變過程類似于人的椎間盤退變。髓核化學(xué)融解術(shù)具有在非開放性手術(shù)下進行、創(chuàng)傷小、操作簡單等優(yōu)點，其缺點是髓核內(nèi)注射的藥物可影響以后生物化學(xué)檢測的準確性?？傊?，采用纖維環(huán)切開法和注射化學(xué)酶等方法在家兔、狗、羊等動物上誘導(dǎo)出IVDD模型，其退變原因為纖維環(huán)或椎間盤巨大物理化學(xué)損傷，與引起人體IVDD的積累性輕微損傷變化不同。最大缺點是這些模型均為四肢爬行動物，誘導(dǎo)的IVDD未體現(xiàn)最主要的致退變因素――重力作用。

3自發(fā)性椎間盤退變模型

Platenberg發(fā)現(xiàn)，靈長類動物在大于14歲時即可出現(xiàn)自發(fā)性IVDD，影像學(xué)檢查顯示這種改變類似于人椎間盤退變。Hansen［24］首次報道軟骨發(fā)育不良犬椎間盤退變情況。Gillett等［25］對畢格犬的椎間盤研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增大其椎間盤亦發(fā)生退變，且組織化學(xué)和生物化學(xué)的退變征象早于放射學(xué)的改變，其退變征象與人類IVDD征象相似。Moskowitz［26］及Gruber等［27］報道給地中海沙鼠喂養(yǎng)一種標準的實驗食物可引起糖尿病和廣泛的椎間盤退變，如脊索細胞丟失、終板硬化、纖維環(huán)結(jié)構(gòu)破壞、細胞組織變形、周邊骨贅形成等，這些形態(tài)和細胞的變化與其生物力學(xué)改變密切相關(guān)。取這些動物作為動物模型在一定程度上減少了人為因素的影響，可直接對實驗對象進行觀察。但這些動物種類和數(shù)量有限，價格昂貴，難以大量用于科研活動。

4討論

動物實驗研究的根本在于模型研究結(jié)果與人類的相關(guān)性，人椎間盤退變后組織結(jié)構(gòu)和細胞學(xué)方面發(fā)生的變化可通過動物模型模擬出來，這對制定椎間盤退變的預(yù)防和治療策略具有重要意義。然而，動物模型有其局限性，因為通過動物模型觀察的退變過程時間相對較短，在觀察過程中很多指標無法監(jiān)測，并且不能完全模擬人椎間盤退變。人椎間盤結(jié)構(gòu)重組過程主要基于其多年受損害的長期積累引起的變化。動物模型和人椎間盤之間的區(qū)別不僅應(yīng)考慮物種的不同，其病因和結(jié)果之間關(guān)系也可不完全一樣，人椎間盤與動物椎間盤之間的最大區(qū)別是椎間盤大小和細胞類型不一樣。椎間盤的大小受椎間盤營養(yǎng)需要和生物力學(xué)的影響，并影響其生物學(xué)進程。嚙齒類動物椎間盤的生物力學(xué)特性類似于人類，但這類動物椎間盤面積小，不像人椎間盤需要較多的營養(yǎng)供應(yīng)，即小動物椎間盤小，需要的營養(yǎng)供給少，不容易發(fā)生損傷和退變，容易修復(fù)；而人類則相反，椎間盤較大，需要的營養(yǎng)多，損傷后不容易修復(fù)。所以，小動物椎間盤退變模型實際上與人椎間盤退變之間始終存在差距［28］。大鼠和兔的椎間盤盡管小，但它的MRI檢查結(jié)果與人椎間盤的反應(yīng)明顯相關(guān)，故通過這些動物模型仍可對人椎間盤進行很好的研究［2］。盡管通過動物模型研究復(fù)雜組織中椎間盤退變的因果關(guān)系受到多方面限制，但從動物模型中得出的結(jié)果對于制定保護機制和治療策略仍然具有重要作用。髓核的體積是椎間盤發(fā)生退變的本質(zhì)特點，當其減小時，即促發(fā)椎間盤疾病。維持或重建髓核的滲透機制，保持椎間盤體積，可能是提高臨床介入治療手段的核心。

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