HCV核心區(qū)基因的截短及其表達(dá)

HCV核心區(qū)基因的截短及其表達(dá)【摘要】目的高效穩(wěn)定地表達(dá)HCV的核心抗原。方法設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以含HCV全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒pBRTM/HCV1-3011為模板，擴(kuò)增出HCV截短的核心抗原的基因，克隆于表達(dá)載體pGEX-4T3,并轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21,IPTG誘導(dǎo)HCV截短的核心抗原的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過SDS,Western-blot,ELISA等一系列鑒定試驗(yàn)進(jìn)行了分析。結(jié)果成功地構(gòu)建了HCV核心抗原高效穩(wěn)定表達(dá)的重組質(zhì)粒，表達(dá)產(chǎn)物具有高度特異性和良好的抗原活性。結(jié)論該抗原的獲得為研制診斷用HCV抗原奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】HCV；核心區(qū)基因；截短；表達(dá)

TruncationandexpressionofHCVCoregene

【Abstract】ObjectiveToexpressHCVCoreantigenhightlyandApairsofspecificPCRprimersweredesignedandHCVCoregenewasamplifiedfromtheplasmidpBRTM/HCV1-3011bygenefragementwasclonedintopGEX-4T3,thentransformedtoBL21andexpressedunderinductionofIPTG.TheexpressedproductwasanalyzedbySDS,Western-blotandindirectELISA,Arecombinantplasmidstableandhightexpressionwasconstructedsuccessfully.TheexpressedproductshowedhighspecificityandgoodTheexpressionoftruncatedHCVCoreantigenslaidafoundationfordevelopmentofHCVdiagnostisuseantigens.

【Keywords】HCV；Coregene;Truncation；expression

丙型肝炎病毒的核心蛋白是HCV蛋白中抗原性強(qiáng)且保守性較好的區(qū)段，核心抗體出現(xiàn)時(shí)間早，大約于感染后8～12周即可檢出，且持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)，陽性率高，是HCV診斷必不可少的抗原之一［1］。為了研制HCV診斷用抗原，最初構(gòu)建了含HCV全長(zhǎng)核心基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，但該質(zhì)粒表達(dá)不穩(wěn)定。參照有關(guān)文獻(xiàn)［2～4］，筆者將HCV的核心基因截短，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠高效穩(wěn)定地表達(dá)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)材料含HCV全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒pBRTM/HCV1-3011由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院葉林柏教授惠贈(zèng)；pGEX-4T3購自AmershamBiosciences公司；pGEM-T載體為Promega公司產(chǎn)品；大腸桿菌JM109,DH5α和BL21均由武漢生物制品研究所診斷用品室保存。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及TaqDNA聚合酶為Fermentas公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒為QIAGENGmbH公司產(chǎn)品；序列分析由寶生物工程公司完成。IPTG購于Fermentas公司；GST融合蛋白純化試劑盒為AmershamBiosciences公司產(chǎn)品；鼠抗HCVCore抗原和NS3抗原的兩種單克隆抗體購自ViroStat公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為NovoGeneBioscience公司產(chǎn)品；DAB濃縮顯色液為華美生物工程公司產(chǎn)品；ELISA所用試劑，除抗原外，均為武漢所的HCV抗體診斷試劑盒的組份；標(biāo)化血清由武漢所診斷用品室根據(jù)第5代HCV-Ab國家參比品(Panel)標(biāo)定的血清樣品。

12引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)pBRTM/HCV1-3011全長(zhǎng)基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增HCV截短的(1-120aa)核心抗原基因片段的特異引物。

上游引物(L)：5’GACGCGTGGATCCBamHIATGAGCACGAATCCTAAACC3’

下游引物(R)：5’GTCCGCCGAATTCGAEcoRIACTACCCAAATTGCGCGA3’

上游引物L(fēng)5’端加了限制性內(nèi)切酶BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物R5’端加入限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切位點(diǎn)。以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

13PCR擴(kuò)增以pBRTM/HCV1-3011為模板，用上述引物擴(kuò)增出截短的HCVCore區(qū)基因片段，取5μl進(jìn)行10%瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，按照DNA凝膠純化試劑盒操作步驟純化回收目的片段。

14表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建純化的目的基因片段，經(jīng)T4DNA連接酶與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109,篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒后，經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切反應(yīng)，回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶與經(jīng)同樣雙酶切的pGEX-4T3連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，提取質(zhì)粒后，經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切鑒定，篩選出含目的基因片段的陽性克隆，并測(cè)序，再將陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21。

15融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將含有目的基因重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TP11的BL21菌株，接種于含100μg/ml氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后，按1：100比例轉(zhuǎn)種于新鮮2YT培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A600=05～07)，加IPTG至終濃度為1mmol/L,誘導(dǎo)4～5h，取菌體用于SDS分析。

16融合蛋白的純化將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體超聲破碎后，包涵體經(jīng)洗滌，8mol/L尿素溶解，稀釋復(fù)性，加50％預(yù)處理的親和層析介質(zhì)GlutathioneSepharose4B,按試劑盒說明書進(jìn)行純化。

17Western-blot分析純化的嵌合抗原，經(jīng)SDS電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，按文獻(xiàn)提供方法進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)移［5］。一抗分別為1∶30倍稀釋的鼠抗HCV的Core抗原和NS3抗原的單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，DAB顯色。

18HCV標(biāo)化血清的鑒定用包被緩沖液稀釋純化的融合蛋白至3μg/ml，包被微孔板，每孔100μl，4℃過夜，充分洗滌后,每孔加200μl封閉液，4℃過夜，充分洗滌后加入按1∶10稀釋的HCV標(biāo)化血清。37℃孵育30min，充分洗滌后加入抗人IgG酶結(jié)合物，37℃孵育30min，充分洗滌，加顯色底物顯色10min，加入50μl2mol/L硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)讀數(shù)儀上測(cè)定A450值。

2結(jié)果

21PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定引物L(fēng)、R設(shè)計(jì)擴(kuò)增的片段長(zhǎng)394bp，以質(zhì)粒pBRTM/HCV1-3011為模板，用引物L(fēng)、R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見擴(kuò)增的產(chǎn)物為約400bp的DNA片段,見圖1，大小與預(yù)期設(shè)計(jì)相同。

22克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定HCV截短的(1-120aa)核心抗原基因克隆到載體pGEM-T上后的克隆質(zhì)粒pGEM-TP11，經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果可見pGEM-TP11酶切產(chǎn)物大小約為400bp和3kbp左右的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相同，見圖2。

23重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定從轉(zhuǎn)化的DH5α中提取重組質(zhì)粒pGEX-TP11，用BamHI/EcoRI雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見表達(dá)載體pGEX-4T3(約5kbp)及TP11(約400bp)基因兩個(gè)片段，大小與預(yù)期設(shè)計(jì)的相同，見圖3。

24重組表達(dá)質(zhì)粒的序列測(cè)定測(cè)序結(jié)果表明pGEX-TP11中目的基因除了第68位氨基酸殘基密碼子由GCG突變?yōu)镚CA為同義突變之外，其余序列與模板相同。

25重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)鑒定過的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TP11,轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21，挑取陽性克隆，經(jīng)常規(guī)誘導(dǎo)表達(dá)后，取菌體作SDS分析，結(jié)果顯示，目的蛋白為相對(duì)分子量約40kDrGST-P11融合目的蛋白(Lane2)，與預(yù)計(jì)的表達(dá)產(chǎn)物分子量大小相符。SDS凝膠經(jīng)掃描分析表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白量的236％，結(jié)果見圖4。

26純化表達(dá)產(chǎn)物鑒定含重組質(zhì)粒pGEX-TP11的表達(dá)菌，經(jīng)大量誘導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物純化，純化過程中收集的各種樣品進(jìn)行SDS分析。表達(dá)菌超聲破碎后收集的上清和沉淀中均可見大量的約40kDrGST-P11融合目的蛋白(Lane1、2)，說明融合蛋白部分是以可溶形式表達(dá)，部分是以包涵體的形式表達(dá)；包涵體經(jīng)尿素溶解后的上清有大量的目的蛋白，沉淀中有少量目的蛋白(Lane3、4)，說明包涵體已大部分溶解；表達(dá)菌超聲破碎后收集的上清與50％預(yù)處理的親和層析介質(zhì)GlutathioneSepharose4B孵育后上柱，收集的流出液中可見

少量的目的蛋白(Lane5)，說明大部分目的蛋白已被GlutathioneSepharose4B特異地吸附，而收集的PBS洗柱液可見少量目的蛋白和GST條帶(Lane6、7)；收集純化rGST-P11只可見一條約40kD目的蛋白帶(Lane8),凝膠經(jīng)掃描分析，其純度為938％,結(jié)果見圖5。

27表達(dá)產(chǎn)物Western-blot分析純化的重組融合蛋白rGST-P11,經(jīng)SDS電泳后，電泳轉(zhuǎn)至NC膜，進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果為重組融合蛋白rGST-P11只與鼠抗HCVCore抗原的單克隆抗體起反應(yīng)，在分子量約40kD位置出現(xiàn)反應(yīng)區(qū)帶(Lane1)，而與鼠抗HCVNS3抗原的單克隆抗體不起反應(yīng)，無任何區(qū)帶(Lane2)，見圖6。

28HCV標(biāo)化血清的鑒定重組截短HCVCore抗原包被微孔板對(duì)41份HCV標(biāo)化血清ELISA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果23份陽性標(biāo)化血清中，可檢出20份，有三份的A值小于Cutoff值，按20/23計(jì)算，陽性檢出率為86％；對(duì)18份陰性標(biāo)化血清檢測(cè)，均為陰性，陰性符合率100％，結(jié)果見表1。表1重組HCVCore抗原與41份HCV標(biāo)化血清的ELISA結(jié)果

3討論

HCV的核心蛋白是HCV診斷必不可少的抗原之一，為了研制自己的HCV診斷用抗原，本實(shí)驗(yàn)最先構(gòu)建了含HCV全長(zhǎng)核心基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TP1，最初均有約47kD融合目的蛋白表達(dá)，含該質(zhì)粒工程菌在液氮罐內(nèi)凍存一段時(shí)間后，重新誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，均不再有目的蛋白的表達(dá)。將凍存含正確序列pGEM-TP1質(zhì)粒重新酶切，重新構(gòu)建pGEX-TP1表達(dá)質(zhì)粒，也沒有目的蛋白的表達(dá)。因此，沒能純化出全長(zhǎng)的Core抗原。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，核心蛋白所含堿性氨基酸較多，精氨酸和賴氨酸占15%。研究發(fā)現(xiàn)，全長(zhǎng)型核心蛋白很難獲得穩(wěn)定表達(dá)，而截短型Core蛋白，通過羧基端缺失,去除疏水區(qū)對(duì)表達(dá)的影響，原核表達(dá)高效且穩(wěn)定，在真核細(xì)胞中也有較高水平的表達(dá)［4］。據(jù)此，重新合成引物，將Core區(qū)截短，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TP11，獲得了穩(wěn)定的表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白量的236％。

純化的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果只與鼠抗HCVCore抗原的單克隆抗體起反應(yīng)，而與鼠抗HCVNS3抗原的單克隆抗體不起反應(yīng)，證明了其抗原的特異性良好。

純化的表達(dá)產(chǎn)物包被微孔板后，對(duì)41份HCV標(biāo)化血清進(jìn)行了ELISA檢測(cè)，23份陽性HCV標(biāo)化血清可檢測(cè)出20份陽性，陽性檢測(cè)率為86％，如包被的抗原中增加NS3、NS4、NS5抗原，其陽性檢測(cè)率將會(huì)大幅度增高；對(duì)18份陰性HCV內(nèi)控血清檢測(cè)全部為陰性，陰性符合率為100％，說明表達(dá)產(chǎn)物具有高度特異性和良好的抗原活性。

【參考文獻(xiàn)】

1Abdel-HamidM,El-Dalym,El-KaframyS,etal.Comparisonofsecondandthird-generationenzymeimmunoassaysfordetec