熒光壽命測定的現(xiàn)代方法與應用

熒光壽命測定的現(xiàn)代方法與應用第一頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三七彩的熒光第二頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三熒光及熒光分光光度計的發(fā)展熒光壽命的基本原理熒光壽命測定的現(xiàn)代方法及數(shù)據(jù)處理測定熒光壽命的一些應用測定熒光壽命的儀器主要內容第三頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三

Theemissionoflightfromanysubstanceiscalledluminescence.Someofthefirstscientificreportsofluminescenceappearedinthemiddleofthe18thcentury.In1845,Herschelobservedthatanotherwisecolourlesssolutionofquinine(quinineabsorbsintheUVregion)inwateremittedabluecolourundercertaincircumstances.In1852SirG.G.Stokesstudiedthesamecompoundandfoundthattheemittedlighthasalongerwavelengththanthelightabsorbed,theso-calledStokes’shift.(firstdescribedfluorescence)Inthe1920sand1930sJab?ońskiinvestigatedpolarizedlightandfluorescenceandwasabletoshowthatthetransitionmomentsinabsorptionandemissionaretwodifferentthings.TheDevelopmentofFluorescence第四頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三Thefirstfluorescencemicroscopesweredevelopedbetween1911and1913byGermanphysicistsOttoHeimsttandHeinrichLehmannasaspin-offfromtheultravioletinstrument.Itwasn'tuntiltheearly1940sthatAlbertCoonsdevelopedatechniqueforlabelingantibodieswithfluorescentdyes,thusgivingbirthtothefieldofimmunofluorescence.Bytheturnofthetwenty-firstcentury,thefieldoffluorescencemicroscopywasresponsibleforarevolutionincellbiology,couplingthepoweroflivecellimagingtohighlyspecificmultiplelabelingofindividualorganellesandmacromolecularcomplexeswithsyntheticandgeneticallyencodedfluorescentprobes.

TheDevelopmentofFluorescenceMicroscopes

第五頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三

Basictheoryoffluorescence

Lifetime

Thephotophysicalprocessesthatoccurfromabsorptiontoemissionareoftenshowninaso-calledJab?ońskidiagram.第六頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三第七頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三

熒光是分子吸收能量后其基態(tài)電子S0被激發(fā)到單線激發(fā)態(tài)S1或S2后由第一單線激發(fā)態(tài)S1回到基態(tài)S0時所發(fā)生的。

熒光壽命是指分子在單線激發(fā)態(tài)S1所平均停留的時間，或者說處于激發(fā)態(tài)S1的分子數(shù)目衰減到原來的1/e所經(jīng)歷的時間。

由于熒光現(xiàn)象多發(fā)生在納秒級,這正好是分子運動所發(fā)生的時間尺度,因此利用熒光技術可以“看”到許多復雜的分子間作用過程,例如超分子體系中分子間的簇集、固液界面上吸附態(tài)高分子的構象重排、蛋白質高級結構的變化等。熒光壽命的概念第八頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三熒光壽命測定的現(xiàn)代方法

熒光壽命測定的現(xiàn)代方法主要有以下幾種，即時間相關單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting，TCSPC)

、頻閃技術(StrobeTechniques)、相調制法(PhaseModulationMethods)

、條紋相機法(StreakCameras)和上轉換法(Upcon-versionMethods)。第九頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三時間相關單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)

TCSPC是目前主要應用的熒光壽命測定技術，1975年由PTI(PhotonTechnologyInternational)公司首先商品化。此外,EdinburghInstruments、IBH、HORIBA等公司也在生產(chǎn)基于TCSPC的時間分辨熒光光譜儀。

第十頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三時間相關單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)TCSPC的工作原理如圖所示電信號電信號累積電壓信號停止工作熒光第十一頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三以光子數(shù)對時間作圖可得到如圖所示的直方圖,此圖經(jīng)過平滑處理得到熒光衰減曲線。時間相關單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)第十二頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三時間相關單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)

實際測定中,必須調節(jié)樣品的熒光強度,確保每次激發(fā)后最多只有一個熒光光子到達終止光電倍增管。否則會引起“堆積”效應(PileupEffect)?！岸逊e”效應是指熒光衰減曲線向短壽命一方偏移的現(xiàn)象。

為了避免堆積效應,實際測定時,多道分析儀存儲的光子數(shù)大致只有光源脈沖數(shù)的1%。也就是說,光源100次脈沖,大約只有1次所引發(fā)的熒光被檢測。第十三頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三

TCSPC法的突出優(yōu)點在于靈敏度高、測定結果準確、系統(tǒng)誤差小,是目前最流行的熒光壽命測定方法。但是這種方法所用儀器結構復雜、價格昂貴、而且測定速度慢,無法滿足某些特殊體系熒光壽命測定的要求。時間相關單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)第十四頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三

頻閃技術(StrobeTechniques)

頻閃技術也叫脈沖取樣技術(PulseSam-plingTechniques)，1987年PTI公司將納秒級頻率熒光壽命測定儀商品化。最近PTI公司推出了新一代頻閃分時光譜儀。脈沖取樣法測定熒光壽命工作原理如下圖所示。(a)工作原理圖(b)檢測時間門與熒光衰減關系示意圖第十五頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三頻閃技術(StrobeTechniques)的優(yōu)缺點：新一代頻閃分時光譜儀有著TCSPC的準確性，比相調制測定速度更快，操作也很方便，儀器價格也大大降低。不過脈沖法得到的熒光衰減曲線包含噪音的水平尚無法知道，在數(shù)據(jù)分析時應當有所估計。頻閃技術(StrobeTechniques)第十六頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三

熒光壽命測定中的數(shù)據(jù)處理

1、熒光壽命及其含義

假定一個無限窄的脈沖光(δ函數(shù))激發(fā)n0

個熒光分子到其激發(fā)態(tài),處于激發(fā)態(tài)的分子將通過輻射或非輻射躍遷返回基態(tài)，兩種衰減躍遷速率分別為Γ和knr

，可得到激發(fā)態(tài)物種的單指數(shù)衰減方程。n(t)=n0exp(-t/τ)(1)式中τ為熒光壽命。由于熒光強度正比于衰減的激發(fā)態(tài)分子數(shù),因此可將上式改寫為:I(t)=I0exp(-t/τ)(2)其中I0

是時間為零時的熒光強度。于是,熒光壽命定義為衰減總速率的倒數(shù):τ=(Γ+knr)-1(3)也就是說熒光強度衰減到初始強度的1/e時所需要的時間就是該熒光物種在測定條件下的熒光壽命。實際上用熒光強度的對數(shù)對時間作圖,直線斜率即為熒光壽命倒數(shù)的負值。熒光壽命也可以理解為熒光物種在激發(fā)態(tài)S1的統(tǒng)計平均停留時間。第十七頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三

3、卷積積分

實際測定得到的熒光衰減曲線N(tk

)是儀器響應函數(shù)L(

tk

)和真實熒光衰減函數(shù)I(t)的卷積。即N(tk)=L(tk)Θ

I(t)

第三條曲線是實測熒光強度衰減曲線的擬合函數(shù)Nc(tk)。熒光壽命測定中的數(shù)據(jù)處理時間/ns光子數(shù)上圖

給出用TCSPC法測得的閃爍體(Scintil-lator)2,5-二苯基-1,3,4-二唑(2,5-diphenyl-1,3,4-oxadiazole,PPD)的熒光強度衰減曲線及其擬合。第十八頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三

4、數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析的目的在于,通過擬合實驗所得熒光衰減曲線,建立一種最能揭示熒光衰減本質、描述衰減過程的理論模型,從而對所研究體系作出深刻的理解。隨著時間分辨熒光技術日益發(fā)展,人們相繼提出了多種熒光衰減數(shù)據(jù)分析方法。例如:非線性最小二乘法、矩法、Laplace變換法、最大熵法以及正弦變換法等。熒光壽命測定中的數(shù)據(jù)處理

利用解卷積的辦法可得到脈沖響應函數(shù)I(t),進而求得描述樣品熒光衰減本質的熒光壽命(τ)等有關參量。

第十九頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期三

熒光壽命測定的應用

熒光技術分為靜態(tài)熒光技術和時間分辨熒光技術。靜態(tài)熒光技術固然重要,但是靜態(tài)技術給出的只是平均化結果,平均化過程丟掉了有關分子運動的動態(tài)信息。所以時間分辨熒光技術較為常用.時間分辨熒光技術的應用:1、可以揭示熒光猝滅是自由擴散控制還是特異性結合控制。2、研究供體和受體間的能量轉移時,不僅可以得到能量轉移效率,而且可以揭示受體在供體周圍的分布形式。3、揭示熒光猝滅是自由擴散控制還是特異性結合控制。4、研究許多分子間或分子內的弱相互作用信息,特別是動態(tài)信息。5、對于表面活性劑類兩性分子在溶液或界面上的組裝、納米材料在儲存過程中的相互聚集、蛋白質或其它大分子在固液界面吸附過程中的構象調整、大分子與大分子,大分子與小分子,大分子與金屬離子等相互作用所引起的大分子構象變化以及這種變化發(fā)生的程度和部位位等重要問題可能通過時間分辨熒光技術進行深入研究。第二十頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期