甲狀腺癌功能性miRNA地鑒定、臨床意義及其作用機制

甲狀腺癌功能性miRNA的鑒定、臨床意義及其作用機制開題報告人:王培松指導教師:陳光教授報告內(nèi)容1.背景及選題依據(jù)2.研究目的及意義3.研究內(nèi)容及關鍵問題4.研究方法5.研究條件6.研究進度及具體安排7.本題創(chuàng)新之處8.預期結果背景及選題依據(jù)甲狀腺癌發(fā)病占甲狀腺結節(jié)的5-20%、全身腫瘤的1.5%，是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。近年許多資料顯示甲狀腺癌的發(fā)病率逐年上升,是近年備受關注的腫瘤之一,也是內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤領域的研究熱點。2008年估計美國新發(fā)病例37340,1590人死于甲狀腺癌。由于甲狀腺癌多起病隱匿,常以無痛性甲狀腺結節(jié)為最初臨床表現(xiàn),因此早期診斷較為困難。目前常用診斷方法包括觸診、超聲、核素顯像、細針穿刺細胞學活檢等,其中細針穿刺細胞學活檢是篩查和早期診斷甲狀腺癌的有效方法,但仍然存在一定的假陰性率和部分無法確診的病例,且需考慮患者的依從性。因此，研究鑒定早期診斷預警分子，是目前甲狀腺癌臨床研究所面臨的瓶頸問題，有重要臨床意義。越來越多的實驗數(shù)據(jù)逐步建立了腫瘤與miRNA表達變化的關聯(lián)，提示我們在不同的腫瘤中檢測特定的miRNA的表達變化很可能成為腫瘤診斷、分期和預后預測的有力工具。但甲狀腺癌中的miRNA尚知之甚少。研究目的及意義通過檢測甲狀腺良惡性腫瘤及其配對血清中miRNA的差異表達情況，分析與患者臨床病理特征及其生存情況的相關性，鑒定出與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展，特別是早期癌變密切相關的功能性miRNA。為通過檢測新型miRNA開展甲狀腺癌早期診斷及預后分級提供新途徑。研究內(nèi)容及關鍵問題1、研究候選miRNA在甲狀腺癌中的表達特征與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的相關性。采用定量RT-PCR檢測3-5個候選miRNA在30例甲狀腺癌組織及癌旁正常甲狀腺組織樣本及30例良性甲狀腺疾病組織中的表達；分析這些miRNA與甲狀腺癌患者臨床病理特征及其生存情況的相關性；在此基礎上，從中篩選出1-3個具有重要臨床意義的miRNA。2、檢測不同臨床分期，特別是早期甲狀腺癌患者血清中的上述miRNA的表達變化規(guī)律，分析將這些miRNA作為甲狀腺癌早期診斷預警分子的精準性。3、通過檢測同一患者多發(fā)灶同一miRNA的表達，探討其多灶性起源的原因。4、研究揭示具有重要臨床意義的miRNA在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展，特別是在早期癌變中的功能及其作用機制，為通過檢測新型miRNA開展甲狀腺癌早期診斷及預后分析提供新途徑。通過BrdU和克隆形成等實驗確定miRNA是否與甲狀腺癌細胞的分裂增殖密切相關；通過細胞移動和細胞侵襲等實驗確定候選miRNA是否在甲狀腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用；最后通過定量RT-PCR和免疫印跡（westernblot）等技術手段，確定miRNA所調(diào)控的靶基因，確定作用機制。從甲狀腺癌差異表達miRNA中，篩選出有重要臨床意義者，進一步應用過表達與RNA抑制技術，開展miRNA功能研究，鑒定出功能性miRNA，是本項目的技術關鍵。為此，我們擬選取至少3種甲狀腺癌細胞（ATCcelllinesARO、FRO、KTC-2(derivedfromanaplastictransformedPTC);PTCcelllinesNPA、TPC-1;)FTCcelllineWRO）和3種永生化正常甲狀腺濾泡細胞(如HT-ori3、HEK293T等)，分別進行miRNA過表達或miRNA抑制實驗，從正反多方面進行研究，可確保實驗結果確切，說明問題有力。技術路線 miR-121、miR-122、miR-197miR-121、miR-122、miR-197、miR-346、miR-17-5p和miR-19a等6個候選miRNA660例甲狀腺癌組織及癌旁正常組織樣本及60例良性疾病組織（每份組織臨床資料齊整且均有其術前血清）該部分工作已完成該部分工作已完成詳見可行性分析詳見可行性分析①定量RT-PCR檢測定量RT-PCR檢測60例甲狀腺癌組織及癌旁正常組織樣本及60例良性疾病組織（每份組織均有其術前血清）上述6個候選miRNA的表達量詳見可行性分析②詳見可行性分析②SPSS統(tǒng)計學軟件分析SPSS統(tǒng)計學軟件分析篩選出1篩選出1~3個與腫瘤分裂增殖、侵襲移動或不良預后相關的miRNA在甲狀腺在甲狀腺癌患者癌組織中下調(diào)的miRNA甲狀腺癌患者癌組織中上調(diào)的miRNA1）miRNA抑制劑分別轉(zhuǎn)染3種甲狀腺1）miRNA抑制劑分別轉(zhuǎn)染3種甲狀腺癌細胞（該miRNA在這些細胞中高表達），下調(diào)該miRNA的表達；2）miRNA分別轉(zhuǎn)染正常甲狀腺上皮細胞（該miRNA在這些細胞中低表達）使miRNA的表達量升高1）miRNA分別轉(zhuǎn)染3種甲狀腺癌細胞（該miRNA在這些細胞中低表達），上調(diào)該miRNA的表達；2）miRNA抑制劑分別轉(zhuǎn)染正常甲狀腺上皮細胞（該miRNA在這些細胞中高表達）使miRNA的表達量降低詳見可行性分析③詳見可行性分析③分析細胞移動和侵襲能力(分析細胞移動和侵襲能力(Chamber移動實驗和侵襲實驗)分析細胞分裂增殖能力（BrdU實驗和克隆形成實驗）詳見可行性分析④詳見可行性分析④不同臨床分期，特別是早期甲狀腺不同臨床分期，特別是早期甲狀腺癌患者血清中上述miRNA的表達變化規(guī)律miRNA靶基因的表達（定量RT-PCR和免疫印跡）鑒定出與鑒定出與正常甲狀腺上皮癌變、早期癌變、甲狀腺癌細胞分裂增殖、移動和侵襲等腫瘤生物學行為密切相關的功能性miRNA并鑒定其在多灶性甲狀腺癌中的表達情況研究進度及具體安排2010年2月至2010年7月，臨床標本資料收集整理。2010年7月至2010年10月定量RT-PCR檢測候選miRNA在30例甲狀腺癌組織及癌旁正常組織樣本及30例良性疾病組織（每份組織均有其術前血清）中的表達量，并分析它們的表達與患者的臨床病理特征及其生存情況的相關性，篩選出1-3個具有潛在臨床意義的miRNA。2010年10月至2010年12月，鑒定具有潛在臨床意義的miRNA（1-3個）在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能及其作用機制。在課題實施過程中，根據(jù)課題進展情況，隨時總結實驗結果，撰寫研究論文。研究條件吉林大學第一醫(yī)院甲狀腺外科每年可完成數(shù)百例（400例以上）甲狀腺癌切除手術，本試實驗新鮮標本來源充足吉林大學第一醫(yī)院病歷資料系統(tǒng)吉林大學第一醫(yī)院病理資料庫吉林大學白求恩基礎醫(yī)學部生化實驗室吉林大學第一醫(yī)院病理科高年資醫(yī)師閱片本題創(chuàng)新之處及成果價值1.發(fā)現(xiàn)某種新型的miRNA類甲狀腺癌早期診斷預警分子。研究鑒定早期診斷預警分子，對甲狀腺癌早期診斷有重要臨床意義。針對這一突出臨床問題，本研究擬通過檢測甲狀腺良惡性腫瘤及其配對血清中miRNA的差異表達情況，揭示它們在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展，特別是在早期癌變中的功能及其臨床意義。在研究過程中將可能發(fā)現(xiàn)某種新型的miRNA類甲狀腺癌早期診斷預警分子或甲狀腺癌的腫瘤特異性標志物，因此本項目的創(chuàng)新性十分明顯。2.從血清中鑒定出新型miRNA類甲狀腺癌早期診斷預警分子。miRNA在其它腫瘤患者血清中表達情況已有報道，但在甲狀腺疾病中的研究很少，本項目在檢測甲狀腺良惡性腫瘤中miRNA的差異表達情況同時檢測其配對血清中miRNA的差異表達情況，未來有望通過檢測血清miRNA來早期發(fā)現(xiàn)甲狀腺腫瘤。3.首次通過同一患者多發(fā)灶miRNA表達差異性情況，驗證其多灶性起源問題。多發(fā)病灶是甲狀腺乳頭狀癌的臨床特征之一，文獻報道發(fā)生率為18％～87％。多發(fā)病灶具有更高的惡性特征，表現(xiàn)為頸淋巴結轉(zhuǎn)移及甲狀腺外浸潤的比例更高；多灶源于腺內(nèi)轉(zhuǎn)移還是多克隆起源目前仍有爭議。本項目首次通過同一患者多發(fā)灶miRNA表達差異性情況，驗證其多灶性起源問題。4.在獲得甲狀腺癌差異表達新miRNA的基礎上，率先研究揭示這些miRNA分子在甲狀腺癌中的功能及其作用機制。由于研究起步較晚，迄今為止，在甲狀腺癌中，作為一類具有重要調(diào)控功能的小R