生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用

生物技術(shù)在食品致病微生物檢測中的應(yīng)用第一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三食品中致病微生物的檢測技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)運用到有食品檢測方面，主要是針對一些有害微生物的核酸進行研究通過核酸雜交和核酸合成等反應(yīng)快速檢測樣品中是否含有特定的有害微生物，并進一步確定其含量，其中最主要的技術(shù)包括PCR技術(shù)、DNA探針技術(shù)和基因芯片技術(shù)。第二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三1.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

（1）傳統(tǒng)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreation,PCR)是1985年誕生的一項體外擴增DNA的方法，是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)，體外擴增特異DNA片段的技術(shù)。通過對人工難以培養(yǎng)的微生物相應(yīng)DNA或RNA片段的擴增，檢測擴增產(chǎn)物含量，從而快速的對飼料中致病菌含量進行檢測。第三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三李秀娟等（2009年）對117株金黃色葡萄球菌的nuc片段進行了PCR擴增和焦磷酸測序，結(jié)果顯示所建立的PCR方法能對117株金葡菌進行準確檢測，焦磷酸測序結(jié)果的一致性進一步驗證了PCR擴增結(jié)果的特異性，說明該方法針對目前所用的研究菌株而言，尚未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，具有較高的特異性。

第四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三傳統(tǒng)PCR技術(shù)在實際應(yīng)用中表現(xiàn)出一些缺陷，例如只能定性而不能定量地檢測，且在有死細菌存在的情況下容易產(chǎn)生假陽性、不能檢測致毒微生物產(chǎn)生的毒素等。隨著各項新技術(shù)的出現(xiàn)以及與PCR技術(shù)的有機結(jié)合，發(fā)展起來了一系列改進的PCR技術(shù)。目前應(yīng)用的方法主要有實時熒光定量PCR、多重PCR以及PCR聯(lián)合技術(shù)等。第五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三實時熒光定量PCR實時定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量的方法。該方法可以對GMO進行定量分析，目前已被一些國家的政府實驗室采用。第六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三楊柳等（2011年）根據(jù)沙門氏菌fimY基因序列設(shè)計引物和探針,采用基因重組技術(shù)構(gòu)建用于沙門氏菌檢測的定量標準品，成功構(gòu)建了沙門氏菌重組質(zhì)粒標準品和沙門氏菌實時熒光定量PCR方法，具有較好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。第七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三多重PCR多重PCR是常規(guī)PCR方法的改進，它是在同一個反應(yīng)中同時擴增兩個或多個目標基因序列。這種方法具有更大的可靠性和適應(yīng)性，并且能降低檢測成本。徐偉等（2009年）針對單增李斯特菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因prfA和志賀氏菌侵襲性質(zhì)粒抗原H基因ipaH設(shè)計引物，采用多重PCR對兩種致病菌進行同步鑒定，提供了一種快速且特異性高的同步檢測單增李斯特菌和志賀氏菌的方法。

第八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三PCR聯(lián)合技術(shù)傳統(tǒng)PCR技術(shù)在實際應(yīng)用中表現(xiàn)出一些缺陷，采用一些新技術(shù)與PCR結(jié)合，對PCR技術(shù)的完善和發(fā)展提供了有力的支持，并應(yīng)用在致病菌檢測中。王永等（2009年)探討以16SrDNA保守區(qū)段為PCR擴增對象，運用SSCP技術(shù)對致瀉大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣芽胞桿菌進行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，為食源性致病菌的快速鑒定提供方法依據(jù)。第九頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三劉成志等（2009年）根據(jù)志賀氏菌ipaH基因的保守序列設(shè)計特異性引物，篩選合適的DNA模板制備方法，采用快速常規(guī)PCR和定量實時PCR結(jié)合，對培養(yǎng)液中及乳飲料陽性樣品中的志賀氏菌進行檢測，建立乳飲料中快速檢測志賀氏菌的有效方法。楊大偉等（2011年）應(yīng)用PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)，以A型肉毒梭菌的A型肉毒神經(jīng)毒素基因作為靶基因設(shè)計特異性引物，PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進行快速檢測，最低檢出限可達到為111ng/tube，該方法可以快速、準確檢測A型肉毒梭菌。第十頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三2.核酸探針技術(shù)根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分為DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針，其中DNA探針是最常用的核酸探針。DNA探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補配對的高度精確性，對某一特異性DNA序列進行探查的新技術(shù)。第十一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三微生物經(jīng)過處理后固定于另一固相表面上,經(jīng)洗滌變性后加入DNA探針進行雜交，DNA探針可以與同源性的靶DNA進行互補性結(jié)合，依據(jù)指示劑選用合適的方法進行檢測。目前，DNA探針技術(shù)已經(jīng)在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒等檢測中得到了應(yīng)用。第十二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三續(xù)文彬(2008年)針對單增李斯特氏菌hly部分基因設(shè)計探針，對腸炎沙門氏菌，大腸埃希氏菌，綠膿假單抱病菌，空腸/結(jié)腸彎曲桿菌等非單增李斯特氏菌經(jīng)雜交保護分析后，只有單增李斯特氏菌為陽性結(jié)果，具有較好的特異性。薛力剛等（2010年）通過吖啶酯標記核酸探針的方法檢測病原菌，核酸探針與待檢樣品中金黃色葡萄球菌的rRNA序列進行雜交，形成穩(wěn)定的DNA:RNA雜交體，使用堿液破壞未雜交探針，在堿性過氧化氫中檢測發(fā)光。核酸探針法檢測金黃色葡萄球菌大大縮短了檢測周期，且特異性和敏感性較高，為金黃色葡萄球菌的鑒定提供了一種新方法。第十三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三3.基因芯片技術(shù)基因芯片的主要原理是指將各種基因寡核苷酸點樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴增后制備熒光標記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點雜交，最后通過檢測雜交信號的強度及分布確定檢測樣品中特定微生物的存在。與傳統(tǒng)的微生物檢測方法相比，基因芯片技術(shù)先進性主要體現(xiàn)在高通量檢測、簡便快速、敏感性高等方面，是食品安全方面的重大技術(shù)突破。第十四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三

陳昱等(2009年)利用芯片技術(shù)對志賀氏菌等26株食源性微生物進行檢測，最后成功建立了檢測和鑒定志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157的方法，為3種食源性致病菌的快速檢測和鑒定提供了準確、快速、靈敏的方法。賀晨等（2011年）篩選志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157等11種特異基因作為目的基因，建立了一種運用多重PCR方法結(jié)合基因芯片技術(shù)快速、準確檢測11種常見致病菌的方法，為流行病學(xué)調(diào)查和傳染性疾病的早期診斷和判定提供了一種有效的檢測手段。第十五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三

陸長勇（2009年）針對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、單核細胞增生李斯特菌等8種常見的食源性致病菌建立了基于單堿基延伸標簽反應(yīng)原理的基因芯片檢測方法，其靈敏度可達到0.1pg，以鼠傷寒沙門氏菌為單一檢測對象的細菌純培養(yǎng)物靈敏度可達到5×102CFU/mL。第十六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三結(jié)語生物技術(shù)因其低成本、高效、高通量和高特異性等特點已經(jīng)滲透著食品檢測領(lǐng)域，其優(yōu)越性日趨明顯，成為未來食品安全檢測中的主力軍。但每種方法難免有其局限性，在應(yīng)用中需依具體需要進行選擇或搭配使用，也期待各種方法的優(yōu)化和新技術(shù)新方法的問世，從而為人們賴以生活的食品提供安全和營養(yǎng)的可靠保障。第十七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三參考文獻[1]李秀娟,徐保紅,田會方等.基于PCR的金葡菌準確檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國人獸共患病學(xué)報,2009,25(5):442-445.[2]楊柳,蘇明權(quán),馬越云等.熒光定量RT-PCR檢測沙門氏菌方法的建立[J].中國實驗診斷學(xué),2011,15(1),17-20.[3]徐偉,劉軍,李素芳.單增李斯特菌與志賀氏菌多重PCR檢測技術(shù)的建立[J].中國食品學(xué)報,2009,9(1):201-207.[4]王永,趙新，蘭青闊，朱珠,程奕.4種食源性致病菌的PCR-SSCP檢測技術(shù)研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,15(1):13-15.[5]劉成志，錢凱，李潔莉等.乳飲料中志賀氏菌的快速PCR檢測技術(shù)研究[J].研究報告,2009(1):1-5.第十八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期三[6]楊大偉,劉云國,譚樂義.食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC檢測方法的建立[J].食品工業(yè)科技,2011(6):398-400.[7]續(xù)文彬.單增李斯特氏菌液相核酸探針檢測方法的建立與初步應(yīng)用.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2008,28-31.[8]薛力剛,劉金華,王全凱.金黃葡萄球菌核酸探針檢測方法的建立[J].中國生物制品學(xué)雜志.2010,23(1):91-94.[9]陳昱,潘迎捷,趙勇等.基因芯片技術(shù)檢測3種食源性致病微生物方法的建立[J].微生物學(xué)通報,2009,36(2):285-291.[10]賀晨,孫鴻燕,邵麗筠等.