萊茵衣藻產(chǎn)氫演示文稿

萊茵衣藻產(chǎn)氫演示文稿當(dāng)前第1頁\共有34頁\編于星期一\14點萊茵衣藻產(chǎn)氫當(dāng)前第2頁\共有34頁\編于星期一\14點豆血紅蛋白存在于大豆根瘤中的根瘤菌(以類菌體的形式存在)的固氮酶對氧十分敏感，必須在兼氧的條件下才有固氮的活性，在高氧或者無氧的環(huán)境中是沒有活性的.但是存在于根瘤菌周圍的豆血紅蛋白可與氧進行可逆性結(jié)合，在類菌體的周圍起氧緩沖的作用，成為阻止過多的游離氧接觸固氮酶的屏障，豆血紅蛋白還作為氧的載體，負(fù)擔(dān)著在低氧環(huán)境中為類菌體呼吸提供氧的任務(wù)，使固氮酶免受氧的損害，保持高效的固氮活性。因此本研究將豆血紅蛋白轉(zhuǎn)入衣藻葉綠體中表達，利用豆血紅蛋白與氧氣可逆結(jié)合的性質(zhì)，嘗試在衣藻葉綠體中模擬大豆根瘤細(xì)胞的環(huán)境，創(chuàng)造一個低氧氣環(huán)境的同時，結(jié)合部分抑制PSII活性的措施；提高光合電子傳遞效率，提高衣藻產(chǎn)氫效率。當(dāng)前第3頁\共有34頁\編于星期一\14點當(dāng)前第4頁\共有34頁\編于星期一\14點當(dāng)前第5頁\共有34頁\編于星期一\14點衣藻葉綠體外源基因的轉(zhuǎn)化原理

外源基因轉(zhuǎn)化入衣藻葉綠體時是通過同源重組方式——即靠基因的同源片段的雙交換方式定點將外源基因置換到衣藻葉綠體上。在構(gòu)建葉綠體表達載體時，外源基因表達盒的前后分別連接有衣藻葉綠體基因組的同源片斷，當(dāng)載體進入葉綠體后，同源片斷與受體基因組相應(yīng)的片斷發(fā)生同源重組，外源基因被整合到葉綠體的特定位點，隨葉綠體基因復(fù)制和遺傳，可以消除核轉(zhuǎn)化的“位置效應(yīng)”造成對基因表達的不利影響，實現(xiàn)高效表達當(dāng)前第6頁\共有34頁\編于星期一\14點衣藻葉綠體外源基因轉(zhuǎn)化的方法萊茵衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化的方法主要有基因槍法和電擊法?；驑尫ㄓ址Q高速微粒轟擊法，是在真空室中利用基因槍傳遞的高壓氦氣加速包被著DNA片斷的金屬微粒(金粉或鎢粉)轟擊受體細(xì)胞，這種方法轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、操作簡便、適用于各種細(xì)胞類型，因而可用于衣藻的核轉(zhuǎn)化、葉綠體轉(zhuǎn)化和線粒體轉(zhuǎn)化。電擊法又稱電脈沖法，是利用脈沖電場瞬間作用改變細(xì)胞膜的狀態(tài)和通透性，形成可逆的瞬間通道，外源DNA通過通道進入細(xì)胞。該法操作簡單快速、轉(zhuǎn)化效率高、無菌操作容易控制，也常常用于細(xì)菌和高等植物的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率同玻璃珠法相似。當(dāng)前第7頁\共有34頁\編于星期一\14點實驗方法豆血紅蛋白基因的克?、俅蠖箍俁NA的提取稱取大豆成熟的根瘤o．1g，液氮研磨，抽提大豆的總RNA②RNA濃度和純度的檢測將總RNA稀釋50倍左右，用紫外分光光度計(Eppendorf@BioPhotometer)讀取)OD260和OD280值，計算RNA濃度和純度。當(dāng)前第8頁\共有34頁\編于星期一\14點當(dāng)前第9頁\共有34頁\編于星期一\14點⑤豆血紅蛋白基因lba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA的克隆(1)根據(jù)NCBI發(fā)表的lba基因序列(V00453／J01299)、lbc1-cDNA基因序列(V00452／J01300)、lbc2-cDNA基因序列(V00452／J01301)、1)、Flbr-cDNA基因序列($70187)的序列分別設(shè)計相應(yīng)的特異性引物當(dāng)前第10頁\共有34頁\編于星期一\14點(2)PCR反應(yīng)體系：根據(jù)以上lba、lbc1，lbc2、Flbr的cDNA序列所設(shè)計的特異性引物(合成引物加適量的ddH20溶解，使其終濃度為10umol／L)以Soybean總eDNA為模板，利用常規(guī)PCR技術(shù)分別擴增出Iba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA的基因片段。當(dāng)前第11頁\共有34頁\編于星期一\14點當(dāng)前第12頁\共有34頁\編于星期一\14點(3)PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，一個循環(huán)；94℃變性1min，62℃(1ba,lbc1,lbc2)、退火3.0s，72℃延伸lmin；30個循環(huán)；72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?4)PCR產(chǎn)物的鑒定：用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的大小。如果大小正確,則將PCR產(chǎn)物純化后連接到通用載體pEGM—Easy—TVector(Promega)(以下簡稱Tvector)‘上，再送測序公司檢測PCR產(chǎn)物堿基序列的正確性。當(dāng)前第13頁\共有34頁\編于星期一\14點(5)PCR產(chǎn)物的純化：DNA膠回收(TakaraAgaroseGelDNAPurificationkit)：電泳結(jié)束后，切下含目的片段的瓊脂糖凝膠塊，放入1．5ml離心管中，加入3倍體積BindingBuffer，5℃水浴10min直至徹底融化；將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到柱中，室溫放置2min，8000r／min離心lmin，棄收集管中的廢液；取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的廢液，將柱子放入同一個收集管中，加入500ul‘WashSolution，8000‘r／min離心1min；重復(fù)清洗二次(重復(fù)步驟5)后將UNIQ-10柱子放入一新的1．5ml的離心管中，在柱子膜中央加30uLElutionBuffer(PH>7)，室溫放置2min12000r／min離心1min，離心管中液體即為回收的DNA片段，可立即使用或．20℃冷藏備用。當(dāng)前第14頁\共有34頁\編于星期一\14點載體的構(gòu)建

質(zhì)粒DNA的制備(堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA)收集培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長后期的菌液，用STE緩沖液洗去培養(yǎng)基；菌體懸浮于預(yù)冷的溶液I，激烈振蕩，．使細(xì)胞完全分散：冰浴，加入新鮮配制的溶液lI，快速顛倒離心管幾次，使內(nèi)容物充分混勻；冰浴，加入預(yù)冷的溶液III顛倒離心管溫和振蕩，使內(nèi)容物混勻，冰??；離心，吸取上清移至另一離心管中，加入Tris飽和酚j振蕩混勻；離心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，、用氯仿·異戊醇處理1～2次；向最后吸取的上層水相中加入2倍體積的無水乙醇，輕輕振蕩混合，于室溫中放置沉淀DNA。離心棄上清，加入70％乙醇洗滌沉淀；離心去凈上清液；把沉淀干燥后的沉淀溶于TE．RNA酶緩沖液中，55℃水浴，冷卻到室溫后20℃保存?zhèn)溆?。?dāng)前第15頁\共有34頁\編于星期一\14點以T-lba的DNA為模板擴增lba

基因當(dāng)前第16頁\共有34頁\編于星期一\14點當(dāng)前第17頁\共有34頁\編于星期一\14點構(gòu)建質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)體系在20ul反應(yīng)體系中，加入經(jīng)過BamHl和SacI雙酶切載體DNA(pET-32a)，和經(jīng)過BamHI和SacI雙酶切得目的片段(1ba的酶切產(chǎn)物)用雙蒸水補足體積，14-16℃保溫12～16小時，即可轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。用雙蒸水補足體積，14-16℃保溫12～16小時，即可轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞.當(dāng)前第18頁\共有34頁\編于星期一\14點2．5大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備從37℃倒置培養(yǎng)過夜的平板上挑取單菌落，接種到5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)；再將細(xì)菌以1％的比例接種到100mlLB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3．5小時二次活化至OD600為1．0左右；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一次性使用的冰預(yù)冷的50ml的doff管中，在冰上放置10min，使培養(yǎng)物迅速冷卻到0℃，4℃下4100rpm離心10min，棄上清；用2ml冰預(yù)冷的CaCl2(0.1M)懸浮細(xì)胞，于4℃下4100rpm離心10min重復(fù)兩次；用2ml冰預(yù)冷的CaCl2(0.1M)重懸沉淀，每管取200ul分裝于預(yù)冷的1．5ml離心管中，4℃保存，可用一周當(dāng)前第19頁\共有34頁\編于星期一\14點大腸桿菌的轉(zhuǎn)化取制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放置于冰上；在感受態(tài)細(xì)胞中加入5ul連接產(chǎn)物或1ul質(zhì)粒，輕彈混勻，冰浴30min；42℃(熱激溫度很重要)水浴90s，不要搖動管；快速冰浴1-2min；每管加800ulLB培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)，37℃搖床搖動溫浴45min。將100ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂至37℃預(yù)熱的含相應(yīng)抗生素的LB平板上。將平板放置于超凈臺中吹至液體被吸收；倒置平板，37℃下培養(yǎng)12-16h可出現(xiàn)菌落，4℃保存當(dāng)前第20頁\共有34頁\編于星期一\14點克隆載體的鑒定

取適量克隆載體(或連接產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分別過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，在適當(dāng)濃度的含有EB的瓊脂糖凝膠中電泳，參考對照質(zhì)粒載體或DNAMarker的分子量作初步的判斷，選擇大小正確的克隆進一步用限制性內(nèi)切酶分析和PCR及測序分析當(dāng)前第21頁\共有34頁\編于星期一\14點目的基因在大腸桿菌中的表達及蛋白抗體的制備IPTG誘導(dǎo)目的基因的表達將構(gòu)建好的質(zhì)粒pET-32a-Iba轉(zhuǎn)入宿主BL21中，挑取單個陽性克隆進行劃平板保存并液氮凍存?zhèn)溆?。挑取轉(zhuǎn)化了正確表達的pET-32a-lba的BL21菌單克隆，在含有Ampr抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。當(dāng)OD600達到0.6左右時即可以1％的接種量接入新鮮的含有Ampr抗生素的LB培養(yǎng)基中進行二活。當(dāng)OD600達到0.4時，即可加入終濃度為1mmol／L的IPTG進行誘導(dǎo)，30℃下225rpm振蕩培養(yǎng)，分別在0h、0．5h、1h、2h、4h和6h取出誘導(dǎo)的菌液在4℃下保存，待下一步處理。將上述收集的菌液在4℃下8000rpm離心5min，收集菌體。用tris-Cl(50mM，pH=7.4)清洗細(xì)胞兩次，每次在4℃下12000rpm離心10min，棄上清；最后用1xBindingbuffer重懸菌體，以10s超聲、20S間隔的頻率冰浴超聲30次，等菌液變得澄清之后，在4℃下12000rpm離心10min，上清液為可溶性的蛋白，沉淀為不可溶性的蛋白，分別準(zhǔn)備進行SDS檢測。當(dāng)前第22頁\共有34頁\編于星期一\14點目的蛋白的SDS(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測首先根據(jù)BIO-RAD的說明書安裝玻璃板和電泳儀。配制SDS膠，配方見表2-6。進行SDS電泳：每孔加入約1肛l蛋白樣品，再最后的孔中加入10ul小蛋白maker。剛開始電泳時在濃縮膠中的電壓為60v，溴酚藍(lán)進入分離膠中時電壓調(diào)到80v，溴酚藍(lán)電泳到離膠底處即停止電泳。取出蛋白膠，并用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后鑒定lba蛋白的大小。當(dāng)前第23頁\共有34頁\編于星期一\14點衣藻葉綠體表達載體的構(gòu)建通過對cg40質(zhì)粒的rbcL基因和aadA基因做誘變PCR(圖2—1)(引物為lba-5’-leftprimer和lba-3’一rightprimer)，將存在于3’psbD和rbcL3’UTR之間的單一多克隆酶切位點(multiplecloningsites簡稱為：MCS)轉(zhuǎn)移到aadA和rbcL3’UTR之間，即獲aadA+MCS+rbcL3’UTR串聯(lián)基因，改造后的質(zhì)粒命名為cg40i一i當(dāng)前第24頁\共有34頁\編于星期一\14點當(dāng)前第25頁\共有34頁\編于星期一\14點當(dāng)前第26頁\共有34頁\編于星期一\14點當(dāng)前第27頁\共有34頁\編于星期一\14點．2．5．1衣藻的純化及培養(yǎng)(1)藻種純化培養(yǎng)培養(yǎng)基為Tris-Acetate-Phosphate(TAP)，初始pH=7.2。在TAP培養(yǎng)基中加入質(zhì)量1.5％的瓊脂粉，制成固體培養(yǎng)基平板，再將待分離純化的藻液通過劃線方法接種在平板上，置于培養(yǎng)箱中，25℃培養(yǎng)，每3-4周繼代一次。從平板上挑取單藻落，接入100ml液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中以(光照強度100uE／(m2s)PAR，溫度25士1℃)。的光強光照靜置或水平轉(zhuǎn)速為120rpm培養(yǎng)每5天繼代一1次。(2)萊茵衣藻的擴大培養(yǎng)：在1000ml的三角瓶內(nèi)加入400mlTAP培養(yǎng)基接種萊茵衣藻(接種量為l％)，搖床培養(yǎng)5-7天左右，轉(zhuǎn)速120rpm，光照強度100umol·m-2.s-1，溫度25士1℃。當(dāng)前第28頁\共有34頁\編于星期一\14點用分光光度計測定轉(zhuǎn)基因衣藻849-1ba,cg40、cg40i-i和轉(zhuǎn)基因之前的藻種849的OD750及葉綠素在培養(yǎng)7天內(nèi)的變化情況，制作生長狀態(tài)及葉綠素含量變化曲線圖萊茵衣藻849及849-1ba的生長狀態(tài)比較圖為萊茵衣藻849，cg40,cg40i-i·，及849-1ba的生長狀態(tài)(A)及葉綠素舍量(B)當(dāng)前第29頁\共有34頁\編于星期一\14點對照組(萊菌衣藻849、cg40，cg40i一I,及轉(zhuǎn)基衣藻849lba的生長和葉綠素含量變化趨勢基本一致，藻細(xì)胞均在第3天進入對數(shù)生長期，第4、5天達到飽和期，之后就趨于平穩(wěn)；對照組(轉(zhuǎn)基因藻cg40．cg401一I,與衣藻849)的生長速度基本一致，OD750都在第四天達到3.5左右，約等于細(xì)胞數(shù)為70~80x106個，葉綠素含量達到33mg/L左右，但轉(zhuǎn)基因藻lba的OD750在第四天才達到2.7左右，約等于細(xì)胞數(shù)為6.0—7.0x106個，低于對照組20％左右；葉綠素含量約為27mg／L左右．低于對照組18％左右。該實驗結(jié)果說明，Iba基因的轉(zhuǎn)入在一定程度上會影響衣藻的生長。當(dāng)前第30頁\共有34頁\編于星期一\14點轉(zhuǎn)基因衣藻849-lba與萊茵衣藻849的耗氧及產(chǎn)氫量比較

．本實驗檢測了轉(zhuǎn)lba基因藻849-lba與未轉(zhuǎn)lba基因的衣藻849在密閉培養(yǎng)瓶內(nèi)產(chǎn)氫和耗氧量情況，每天定時監(jiān)測，一共檢測了8天。從圖3-19中看出，在正常TAP中培養(yǎng)中，衣藻849-lba和849的產(chǎn)氫量在培養(yǎng)的前4天基本一樣，而且是隨時間逐漸增加到50-60ul左右；衣藻849在第5天到第8天的產(chǎn)氫量仍然維持在60ul左右，而衣藻849--lba的產(chǎn)氫量在第5天迅速升高到90ul，其最高產(chǎn)氫量比衣藻849高約50％(圖3．19，A)。比較二者的氧氣含量可見培養(yǎng)的前3天，轉(zhuǎn)lba基因比未轉(zhuǎn)基因的衣藻849的氧氣消耗量低了l倍，從第4天開始，轉(zhuǎn)lba基因衣藻含氧量仍然一直維持在5％左右