植物生物技術-植物遺傳轉化載體課件

第十章

植物遺傳轉化載體1?????遺傳轉化常用的選擇標記基因及及無選擇標記基因轉化第一節(jié)

植物遺傳轉化載體的種類及特點第二節(jié)

農桿菌質粒系統(tǒng)的結構、功能和構建第三節(jié)

植物病毒載體第四節(jié)

葉綠體轉化載體第五節(jié)系統(tǒng)本章主要內容第

10章植物遺傳轉化載體2本章教學目的與要求根癌農桿菌

Ti

質粒的結構與功能名詞：一元載體、雙元載體、卸甲載體葉綠體轉化的優(yōu)勢與意義遺傳轉化中常用的選擇標記基因、報告基因3第

10章植物遺傳轉化載體植物遺傳轉化的基礎植物遺傳轉化也稱為轉基因技術

(transgene

technology)是指將人工分離和修飾過的外源基因導入生物體的基因組中，從而使生物體的遺傳性狀發(fā)生改變的技術植物轉基因的優(yōu)越性對植物基因型和表現(xiàn)型的改變只作用于目標性狀，

不涉及非目標累贅基因，因而更具有針對性，可加快育種進程；可克服傳統(tǒng)育種中不同Th物之間的Th殖隔離等限制，擴大可利用的資源庫（動物、植物、微Th物、人工合成基因均可利用）；可創(chuàng)造出自然界所沒有的新種質；以轉基因植物為主體的植物化工廠具有高效、低污染、可再Th的優(yōu)點。第一節(jié)

植物遺傳轉化載體的種類及特點一、植物遺傳轉化載體的特點作為植物遺傳轉化的載體，必須具有兩種功能：1.

能作為媒介將外源基因導入植物細胞中去2.

它能提供被寄主細胞的復制和轉錄系統(tǒng)所識別的

DNA

序列，以保證導入的外源基因能在受體植物細胞中正常復制和表達質粒載體Ri質粒載體共整合載體系統(tǒng)Ti質粒載體雙元載體系統(tǒng)二、植物基因工程載體的種類病毒載體單鏈RNA病毒載體單鏈DNA病毒載體雙鏈DNA病毒載體第二節(jié) 農桿菌質粒系統(tǒng)的結構、功能和構建農桿菌是一類革蘭氏陰性土壤桿菌（

G

－），活在植物根的表面依靠由根組織滲透出來的營養(yǎng)物質（冠癭堿）生存的一類細菌。農桿菌可分為根癌農桿菌

Agrobacterium

tumefaciems

（含

Ti

質粒）和發(fā)根農桿菌

Agrobacterium

rhizogenes （含

Ri

質粒）

，在植物基因工程中以根瘤農桿菌的

Ti

質粒介導的遺傳轉化最多。根癌農桿菌侵染植物后產生冠癭瘤一、根癌農桿菌

Ti

質粒的結構與功能Ti

質粒

(

tumor

induced

Plasmid)

是根癌農桿菌染色體外的遺傳物質，為雙股共價閉合的環(huán)狀

DNA

分子，其分子量為95--156

x

106 D

，約有

150--200kb依據

Ti

質粒誘導的植物冠癭瘤種類的不同，

Ti

質粒可以分為四種類型：

章魚堿型、胭脂堿型、農桿堿型和農桿菌素堿型（

agrocinoPine

）或琥珀堿型（

succinamo

Pine

）Ti

質粒結構T-DNA

區(qū)CytokininAuxin Opine左邊界右邊界Ti

質粒travir

區(qū)Con區(qū)Ori區(qū)T-DNA

區(qū)Auxin左邊界CytokininOpineCon區(qū)右邊界vir

區(qū)Ori區(qū)Ti

質粒tra毒性區(qū)（

vir

區(qū)）：激活

T

－

DNA

的轉移T

－

DNA

區(qū)：

侵染植物時，

從

Ti

質粒上被切割，

轉移到植物細胞中，帶有與腫瘤形成有關的基因存在與細菌間進行接合保證

Ti

質粒進行自我接合轉移區(qū)：有關的基因復制起始區(qū)：復制（一）

T-DNA

的結構特點及功能編長長左左碼冠癭堿的合成，能隨機整合到植物的染色體上。度一般為

12-24kb

，是

Ti

質粒最重要的部分。右邊界分別為

25bP

的重復序列，其中14bP

是核心，是完全保守的。右邊界對于致瘤必不可少。（二）

Vir

區(qū)的結構和功能：該區(qū)段上編碼的基因能激活

T-

DNA

轉移，

使農桿菌表現(xiàn)出毒性，故也稱作致毒區(qū)。

T-

DNA

區(qū)與

Vir

區(qū)在質粒上彼此相鄰，

合起來約占

Ti

質粒

DNA的三分之一Vir

區(qū)段總長度大約

35kb

，由

6

個互補群組成，

分別命名為VirA

、

VirB

、

VirC

、

VirD

、

VirE

、和

VirG

。Vir

區(qū)中各個基因之間都是相互聯(lián)系相互影響的，缺一不可。當

Vir

基因與

T-

DNA

分別位于兩個不同的復制子上時，即

Vir

區(qū)與

T-

DNA區(qū)分割開來以后， Vir

基因仍然能夠為

T-

DNA

提供轉移功能毒性區(qū)中各個位點的表達情況可以分為兩種組成性表達：在無植物誘導分子存在下依然保持一定的表達水平；VirA

屬于組成型表達的位點誘導性表達：即這些基因的表達必須在土壤農桿菌感染植物受傷組織時，植物細胞分泌的信號分子（

乙酰丁香酮及羥基乙酰丁香酮）作用下才能啟動表達；

VirB

、

VirC

、

VirD

和

VirE

是屬于誘導性表達的位點virG

既為組成型表達，也具有誘導表達的特性，

在信號分子的誘導下，表達量提高

10

倍Vir

區(qū)基因的功能：Vir

A

蛋白––

幫助植物細胞接受植物信號分子；Vir

G

蛋白––

對毒性區(qū)的其他基因進行正調節(jié)Vir

B

蛋白––

形成膜通道，

使

T-DNA

轉移到細菌細胞外Vir

D

蛋白––

VirD

1

、 VirD

2

誘導

T-DNA

形成單股

DNA

片段，

并形成復合物（

T-

DNA-

Vir

D2

）；Vir

E

蛋白––

與單鏈

T-DNA

結合（

形成

T

復合物），保護

T-

DNA

不被胞外核酸酶降解轉入植物細胞，

整合到寄主基因組中；Vir

C

蛋白––

與切割單鏈

T-

DNA

有關Vir

F

蛋白––

協(xié)助

T-

DNA

轉移到宿主植物細胞中Vir

H

蛋白對植物產Th的殺菌或抑菌物進行解讀二、發(fā)根農桿菌

Ri

質粒的結構和功能Ri

質粒：

200kb-

800kb

，

其基本結構也與

Ti

質粒相似，

包括致瘤區(qū)（

Vir

區(qū)）、

T-DNA

區(qū)和復制起點

Ori

。根據其合成的冠癭堿種類的不同可分為三類：

農桿堿型、甘露堿型和黃瓜堿型。農桿堿型

Ri

質粒有兩段

T-

DNA

，即

TL

和

TR

，

可以分別插入植物基因組；甘露堿型和黃瓜堿型

Ri

質粒只有單一

T-DNA

，

甘露堿型和黃瓜堿型

Ri質粒的單一

T

區(qū)除其

25bP

邊界重復序列外，其他部分與

Ti

質粒同源性很低，但它們與農桿堿型

Ri

質粒的

TL

區(qū)有較高的同源性。三、

Ti

質粒載體的改造Ti

質粒作為載體的可能性能夠自發(fā)地整合到植物的染色體上。能轉化多種植物。強啟動子：

T-DNA

的

oPine

合成酶基因上有一個強啟動子，能啟動外源基因的表達。天然

Ti

質粒載體的缺點分子量太大（

200kb

），

基因工程中難以操作

；限制性酶切位點太多，

難以找到單一的限制性位點

；T-DNA

區(qū)致瘤基因產物使被轉化的植物細胞成為腫瘤，阻礙細胞的分化和植株再生；在大腸桿菌中不能復制；質粒上存在一些對

T-DNA

轉移不起作用的基因2

、除去

T-

DNA

上的有機堿Th物合成基因（

tmt

）；

因為有機堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，

影響植物細胞的Th長；3

、除去 Ti 質粒上的其它非必需序列，

最大限度地縮短載體的長度；、安裝大腸桿菌復制子，

使其能在大腸桿菌中復制，以利于克隆操作；、安裝植物細胞的篩選標記，如 neor 基因，

使用植物基因的啟動子和Poly

A

化信號序列；、安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。Ti

質粒的改造1

、除去

T-

DNA

上的Th長素（

tms

）和分裂素（

tmr

）

Th物合成基因，

因為大量的Th長素和分裂素會抑止細胞再Th長為整株植物；（一）中間載體中間載體：

帶有重組

T-DNA

的大腸桿菌質粒的衍Th載體目的：

解決體外操作中農桿菌不能直接導入目的基因的困難具有

bom

位點

,

中間載體可以在不同細菌細胞間進行結合轉移能在兩種不同的Th物中復制的，

既能在原核Th物中復制，

又能在真核Th物中復制的載體。具有細菌質粒的復制原點及選擇標記基因，

還有真核Th物的自主復制序列(

ARS)

以及選擇標記性狀具有多克隆位點。卸甲載體由于影響植株再Th的直接原因是

T-DNA

中的

Onc

基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成為無毒的質粒，

即“卸甲”

其“武裝”的

Ti

載體，稱為“卸甲載體”。卸甲載體：構建無毒的

Ti

質粒載體例：

PGV3850:

是從胭脂堿

Ti

質粒

PTiC58

衍Th而來的PGV2250:

是從章魚堿

Ti

質粒

PTiB6S3

衍Th而來的（二）中間表達載體中間表達載體：

是由中間載體（含選擇標記）加上能在植物細胞中表達的啟動子及目的基因構成，也就是嵌合基因插入中間載體后構成。嵌合基因（

chimeric

gene

）外源基因和植物表達元件（啟動子、終止子、

5‘

和3’UTR

內含子、信號肽等）連接在一起構成基因。啟動子Ti

質粒Nos

（

胭脂堿合成酶基因）、

Ocs

（章魚堿合成酶基因）等基因具有與真核Th物啟動子類似的

TATA

盒和

CAAT

盒，均能在植物細胞中表達，

并且無組織特異性。因此，

它們成為早期構建嵌合基因的啟動子。Ca

MV

的

35s

啟動子花椰菜花葉病毒

DNA

的的

35s

啟動子能使嵌合的外源基因在植物細胞中表達。（三

)

植物遺傳轉化載體系統(tǒng)一元載體轉化系統(tǒng)（共整合載體）轉化載體系統(tǒng)雙元載體轉化系統(tǒng)1. 一元載體（

共整合）系統(tǒng)：有

2

個獨立的質粒，農桿菌

Ti

質粒和大腸桿菌中間載體將外源基因裝載到小質粒上，

然后把載有外源基因的小質粒通過同源重組的方法導入農桿菌的

Ti

質粒。Ti

質粒的其他部分PBR322

（含AMPr

）胭脂合成酶基因（

Nos)右邊界（

RB

）左邊界（

LB

）PBR322vector目的基因

重組載體卸甲載體外源基因插入

PGV3850

的過程中間載體共整合載體2.

雙元載體系統(tǒng)是指由兩個分別含

T-DNA

和

Vir

區(qū)的相容性突變

Ti

質粒構成的雙質粒系統(tǒng)

,

又因為其

T-DNA

與

Vir

基因在兩個獨立的質粒上，

通過反式激活

T-DNA

轉移

,

故稱之為反式載體（

trans

vecter

）。穿梭載體（中間載體）主要包括兩個載體（

Ti

質粒）卸甲載體（

Ti

質粒）目的基因目的基因T-DNA

區(qū)左邊界右邊界OriA植物選擇標記基因細菌選擇標記基因OriE中間載體vir

區(qū)細菌選擇標記基因Ori

區(qū)卸甲載體幫助質粒農桿菌農桿菌感染植物接合轉移進入植物細胞核整合，表達VirE.coli穿梭載體左右外源基因Vir左右外源基因左右外源基因雙元載體系統(tǒng)轉化過程Ri

質粒的

T-DNA

上的基因不影響植株的再Th，野Th的

Ri

質粒直接可以用作轉化載體。Ri

轉化載體也有兩種構建策略

:共整合載體：與

Ti

質粒的共整合載體的不同之處是可直接利用野Th型的

Ri

質粒。雙元載體：與

Ti

質粒相同，其原理主要是

Ri

質粒的

Vir基因反式作用驅動

T-DNA

轉移。4.

Ri

轉化載體的改造第三節(jié)

植物病毒載體病毒轉化載體抗原展示型體載互性體補載插入型體載置型體換載雙鏈DNA病毒轉化載體單鏈RNA病毒轉化載體單雙鏈DNA病毒轉化載體一、雙鏈

DNA

病毒轉化載體花椰菜花葉病毒（

CaMV

）：8kb

，

環(huán)狀

ds-DNA

，

8

個

ORF

，

最多可容納

250bP

外源

DNA

，

只能用于短暫表達

(transient

exPression)感染范圍窄；不整合到染色體中；外源基因表達水平高；表達時間較短；二、單鏈

RNA

病毒轉化載體TMV （煙草花葉病毒）載體優(yōu)點：轉化頻率高

;宿主范圍廣

;高拷貝，外源基因高效表達?？蓸嫿乖故据d體三、單鏈

DNA

病毒轉化載體雙生病毒：

2.5-3kb

，環(huán)狀

ss-DNA

，可感染單子葉植物。整合到染色體中；無致病性；免疫原性弱；可長期表達外源基因；四、病毒轉化載體的構建、置換型載體：

外源基因置換病毒基因組的外殼蛋白等基因、插入型載體：外源基因插入到病毒本身啟動子下游、基因互補載體：

外源基因插入到有功能缺陷型病毒組分或亞組分內，可采用

2

種交替突變的病毒，

可同時在宿主中存在、抗原展示型載體：在病毒外殼蛋白基因內選擇性插入外源基因，將外源基因展示在病毒粒子的表面五、病毒載體與質粒載體的比較優(yōu)點植物病毒或其侵染性的基因組是以一定的傳播途徑侵入寄主植物，

由其構建的載體能把外源基因直接導入植物細胞，復雜的裝配過程由細胞完成，而

Ti

質粒載體是通過侵染轉化等復雜的轉移過程而完成Ti

質粒載體轉化時將外源基因整合到植物核基因組上，而病毒載體感染植物后，一般不整合到植物細胞核

DNA

上，從而防止無限傳代擴散，故比較安全可靠病毒載體感染植物細胞以后只是利用寄主細胞的功能在細胞質進行復制和表達；同時又由于病毒具有高效自我復制能力，故在轉化植物中可得到高拷貝外源基因，從而十分有利于外源基因的表達和功能的實現(xiàn)病毒能系統(tǒng)地侵染整株植物，避免了單細胞、原Th質體或組織、器官的轉化和再Th培養(yǎng)，

能較快地獲得轉基因植物植物病毒的寄主范圍較廣，

因而由某種病毒基因組構建的載體可用于多種不同植物的遺傳操作存在的問題：1

、安全性2

、靶向性3

、有效性細胞毒性染色體毒性免疫毒性轉導靶向性轉錄靶向性轉導效率靶向性基因表達水平和持續(xù)時間表達的可調控性第四節(jié) 葉綠體轉化載體一、葉綠體基因組的特點高等植物的葉綠體基因組：①.

多數高等植物的

ctDNA

大約為

150kbP

：煙草ct

DNA

為

155

844bP

、水稻ct

DNA

為

134

525bP

。②.ctDNA

約能編碼

126

個蛋白質：12%

序列是專為葉綠體的組成進行編碼；③.

葉綠體的半自主性：有一套完整的復制、轉錄和翻譯系統(tǒng)，但又與核基因組緊密聯(lián)系。

如,

葉綠體中

RuBP

羧化酶的生物合成

8

個大亞基(

由葉綠體基因組編碼

)+

8

個小亞基

(

由核基因組編碼)二、

葉綠體轉化的發(fā)展三、葉綠體轉化載體的結構左側質體同原序列啟動子5‘UTR

增強區(qū)3’UTR

終止子目的基因啟動子3’UTR

終止子目的基因5‘UTR

增強區(qū)右側質體同原序列外源基因整合的靶位點：

trnV

和

3’rPsl2

間,trnG

和trnfM

間，

trn1

和trnA

間四、表達調控元件（一）

NEP

和

PEP

型啟動子調控元件16SRNA

操縱子的啟動子

Prrn光調控的

psbA

啟動子（二）

5’UTR 的核糖體結合位點噬菌體

T7

基因

10

表達序列

T7g10人工合成的

18bp

包含核糖體結合位點的

rbcL5’UTR（三）

誘導型啟動子（四）

3’UTR 終止子：

TrbcL,TpsbA,

Trbs16,TrrnB（五）

多基因表達元件50bp

的多順反子間基因表達元件煙草葉綠體轉化外源基因定點整合多個基因可以同時表達原核基因無需修飾改造就能直接表達蛋白表達水平高母系遺傳，環(huán)境風險小易于保持純系、后代不分離導入的外源基因性狀穩(wěn)定性高葉綠體基因組轉化的外源基因表達具有組織特異性四、

葉綠體轉化相對于核轉化的優(yōu)勢五、葉綠體基因工程的應用生物反應器農作物遺傳育種，改良農藝性狀理論研究1. 葉綠體生物反應器研究將植物葉綠體作為生物反應器進行生物制藥、表達藥用蛋白和疫苗，

具有許多獨特的優(yōu)勢。它可以大大降低生產和運輸成本、外源蛋白穩(wěn)定性高、易于純化等。這些獨特的優(yōu)勢使葉綠體基因組成為生產食用蛋白和人類藥用蛋白的理想平臺。2. 應用于農作物遺傳育種提高作物抗性抗旱基因、抗病原體蛋白基因、抗蟲基因、抗除草劑基因、耐鹽基因等一些重要的與抗逆相關的基因已經實現(xiàn)葉綠體中的高表達提高作物的營養(yǎng)價值葉綠體參與了許多代謝反應

,

如氨基酸、脂肪酸、淀粉等物質的生物合成。因此

,

通過葉綠體遺傳工程技術

,

改造控制這些反應的酶系統(tǒng)

,

或者直接將有意義的外源基因導入葉綠體

,

將有可能實現(xiàn)葉綠體中高表達人類必需的氨基酸、脂肪酸、蛋白質等營養(yǎng)物質

,

從而提高作物的營養(yǎng)價值。提高作物產量葉綠體能夠把光能轉換成對作物有用的化學能

,

而化學能是作物生物產量形成的基礎能量來源。所以

,

通過改善葉綠體的光合性能

,

比如對光合作用關鍵酶

Rubisco

進行改造

,

能夠提高光合效率

,

進而增加農作物產量。3. 促進基礎理論研究葉綠體基因表達調控機制；核質基因的互作機制；光合作用的機理；葉綠體基因的功能鑒定和葉綠體進化等；第五節(jié)

遺傳轉化常用的選擇標記基因及及無選擇標記基因轉化系統(tǒng)在轉化過程中，僅僅只有極少數植物受體細胞能獲得外源基因，而其中目的基因被整合到受體植物基因組并實現(xiàn)表達的細胞就更少因此，需要盡早對轉化細胞進行選擇，常用的且最簡便的方法是使用特異性選擇標記基因一、選擇標記基因選擇標記基因的特性：不存在于靶標植物細胞中的蛋白質或酶基因小，易于分子克隆可以利用表達元件在植物中充分表達檢測容易，并且能夠定量分析抗Th素選擇標記基因除草劑選擇標記基因安全選擇標記基因二、報告基因報告基因系指其編碼產物能夠被快速測定、常用來判斷外源基因是否成功地導入受體細胞（器官或組織）并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因理想的報告基因的最基本要求：）受體細胞中不存在相應的內源等位基因的活性）它的產物是唯一的，且不會損害受體細胞）具有快速、廉價、靈敏、定量和可重復性的檢測 特性常用報告基因-

葡萄糖醛酸糖苷酶（

GUS

）螢光素酶基因（

Luc

）綠色熒光蛋白（

GFP

）基因-

葡萄糖醛酸糖苷酶（

GUS

）

:編碼酶的作用底物是無色的

X-

葡萄糖苷酸（

X-glucuronide), 將它變成深藍色的

5-

溴

-4-

氯靛藍在一定條件下與底物

X-Gluc

發(fā)Th作用，

產Th蘭色沉淀反應，既可用分光光度計測定又可以直接觀察植物組織形成的蘭色斑點當加入

4-

甲基傘形酮基葡萄糖苷酸（

MUG

）

底物時，產Th

4-

甲基傘形酮，發(fā)熒光。因而可以用熒光光譜法測定熒光素酶

Luc

基因

:最常用的是來自螢火蟲的螢光素酶基因

,

在有氧的條件下，螢光素酶就會催化螢光素進行氧化反應，產Th

AMP

、

CO2

和黃綠色螢光綠色熒光蛋白基因（

GFP

）

:Vitoria來源于發(fā)光Th物水母（

Aequorea）體內的一種發(fā)光蛋白在水母體內，水母蛋（

aequorin

）

與Ca2+

結合時會自發(fā)藍光，

GFP

受此藍光激發(fā)而發(fā)出綠色熒光在實驗室條件下，

用標準的長波長紫外光或者藍光照射時，

GFP

受激發(fā)也能發(fā)出綠色熒光Movie

2三 無選擇標記基因轉化系統(tǒng)（一）位點特異性重組（二）同源重組（三）共轉化系統(tǒng)（四）轉座子系統(tǒng)（一）

位點特異性重組系統(tǒng)位點特異性重組系統(tǒng)是指通過重組酶作用于兩個特定

DNA

序列實現(xiàn)重組。該系統(tǒng)由重組酶及其識別位點組成，當兩個識別位點正向排列時，重組酶可專一性地催化切除兩個識別位點之間的序列。FLR

／

FRTS

重組系統(tǒng)Cre

／

LoxP

系統(tǒng)R

／

RS

系統(tǒng)FRT 是重組酶

FLP

的特異作用位點，

LoxP

位點是重組酶

Cre

的特異作用位點，

RS

是R

的識別位點。來源于

P1

噬菌體的

Cre

重組酶為

34.1KDa

，

由

4

個亞基組成（

2

個