酶分子的化學(xué)修飾課件

酶在實(shí)際應(yīng)用中有局限性1、作為異體蛋白在體內(nèi)難于吸收、易引起免疫反應(yīng)和被識(shí)別降解；2、酶蛋白經(jīng)不起溫度、酸堿、有機(jī)溶劑及時(shí)間的考驗(yàn)，半衰期短、易變性失活；3、酶的活性、作用專一性和最適條件不一定能適應(yīng)生產(chǎn)工藝要求，限制了酶制劑的應(yīng)用范圍。

一、酶分子的化學(xué)修飾概念及其作用

（一級(jí)結(jié)構(gòu)水平的改造）酶的化學(xué)修飾，就是在分子水平上對(duì)酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，以達(dá)到改構(gòu)和改性的目的（側(cè)鏈基團(tuán)的取代、肽鏈的限制性水解、分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)）。達(dá)到：改造酶的作用特性（包括改變酶活性、專一性、對(duì)效應(yīng)物響應(yīng)性能及對(duì)輔助因子的要求）提高酶的穩(wěn)定性擴(kuò)大在體內(nèi)應(yīng)用可能性（防止在體內(nèi)非專一性水解、減少和消除免疫原性以利于醫(yī)療應(yīng)用）化學(xué)修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎(chǔ)上，能夠在較大范圍內(nèi)改變酶的性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的優(yōu)良特性，甚至創(chuàng)造出新的活性。

化學(xué)修飾方法雖多，但基本都是利用修飾劑所具有的各種化學(xué)基團(tuán)特性，或直接或經(jīng)過一定的活化過程，與酶分子上某氨基酸殘基（一般盡量選酶活性非必需基團(tuán)）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。

在醫(yī)藥方面：化學(xué)修飾可以提高醫(yī)用酶的穩(wěn)定性，延長它在體內(nèi)半衰期，抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生，降低免疫原性和抗原性。在生物技術(shù)領(lǐng)域：化學(xué)修飾酶能夠提高酶對(duì)熱，酸，堿和有機(jī)溶劑的耐性，改變酶的底物專一性和最適pH等酶學(xué)性質(zhì)。在酶結(jié)構(gòu)功能研究中：1.研究酶空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，如酶的活性中心研究；2.確定氨基酸殘基的功能；3.測(cè)定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量。決定化學(xué)修飾成敗的關(guān)鍵是修飾的專一性，盡量少破壞必需基團(tuán)，得到高的酶活力回收。為此，有時(shí)需要通過反復(fù)試驗(yàn)來確定。選擇修飾劑選擇酶反應(yīng)條件反應(yīng)的專一性二、酶化學(xué)修飾的基本要求：三、酶分子化學(xué)修飾的主要方法（一）酶分子的主鏈修飾（二）酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾（三）酶分子的化學(xué)交聯(lián)修飾（四）酶分子的大分子結(jié)合修飾（五）酶分子的親和標(biāo)記修飾（六）酶分子的基因修飾（七）與輔助因子相關(guān)的修飾（一）酶分子的主鏈修飾概念：將酶分子的主鏈切斷或者連接，從而使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而改變酶的特性和功能的方法。1主鏈的切斷修飾通過肽酶等手段切斷。比較切斷前后，酶活性的變化，從而探索酶活性中心的位置及主鏈不同位置對(duì)酶活性的影響。2主鏈的連接修飾通過基因融合技術(shù)將兩種或兩種以上的酶基因融在一起。（二）酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)與修飾劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而改變酶分子的性質(zhì)和功能的修飾方法稱為側(cè)鏈修飾基團(tuán)。選擇性修飾試劑必須要與多肽鏈中某—種特定的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并形成緊密共價(jià)結(jié)合。酶分子中經(jīng)常被修飾的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)有：巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫鍵等。側(cè)鏈基團(tuán)修飾的主要作用1.探測(cè)酶和蛋白質(zhì)的必須氨基酸殘基的性質(zhì)和數(shù)目。2.用于酶蛋白的純度的分析與鑒定3.探索酶蛋白作用的化學(xué)機(jī)理4.用于酶蛋白分子的固定化（三）酶分子的化學(xué)交聯(lián)修飾

概念：既可以酶分子內(nèi)部亞基之間，也可以在分子與分子之間。即酶分子的固定化。同型雙亞氨酯氨基雙功能試劑異型碳二亞胺氨基和羧基光活化碳烯或氮烯

分子內(nèi)交聯(lián)增加酶分子表面交聯(lián)鍵的數(shù)目是穩(wěn)定酶的方法之一。分子間交聯(lián)用雙功能或多功能試劑使不同的酶交聯(lián)起來產(chǎn)生雜化酶。（四）酶分子的大分子修飾概念：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。作用：（1）提高酶活力（2）增加酶的穩(wěn)定性（3）降低抗原抗體反應(yīng)根據(jù)修飾分子的大小和對(duì)酶分子的作用方式，可分為大分子的非共價(jià)修飾和大分子的共價(jià)修飾兩類。（1）大分子的非共價(jià)修飾使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物。多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護(hù)酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。（2）大分子共價(jià)修飾用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價(jià)鍵連接于酶分子的表面、形成一層覆蓋層。（五）酶分子的親和標(biāo)記修飾

概念：可以與酶分子的活性部位發(fā)生特異性結(jié)合，并且修飾劑的活性基團(tuán)可以與酶分子的活性部位的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，也可以稱為酶分子的親和標(biāo)記。親和試劑可以專一性地標(biāo)記于酶的活性部位上，使酶不可逆失活，又稱為專一性的不可逆抑制。Ks型抑制劑：根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的，具有和底物結(jié)構(gòu)相似的結(jié)合基團(tuán)，同時(shí)還具有能和活性部位氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)的活性基團(tuán)，導(dǎo)致酶不可逆失活。Kcat:根據(jù)催化過程設(shè)計(jì)的，具有酶的底物性質(zhì)，還有一個(gè)潛在的反應(yīng)基團(tuán)，在酶催化下活化后，不可逆的抑制酶的活性部位。Kcat型也稱為“自殺性抑制劑”，可以用來治療某些疾病的藥物。（六）酶分子的基因修飾對(duì)編碼酶分子的DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)改變，改變酶分子的氨基酸序列（定點(diǎn)誘變），有目的地對(duì)酶分子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行改造，從而達(dá)到對(duì)酶分子進(jìn)行修飾的目的。（七）與輔因子相關(guān)的修飾1對(duì)依賴輔助因子的酶分子的修飾改變輔助因子與酶分子的結(jié)合方式，從而對(duì)酶進(jìn)行修飾。引入新的輔助因子2金屬酶的金屬取代置換酶活性中心的金屬離子，提高酶的活力、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。（一）修飾酶的熱穩(wěn)定性四修飾酶的性質(zhì)（二）修飾酶的抗原性（三）修飾酶對(duì)各類失活因子的抵抗力

（四）修飾酶在體內(nèi)的半衰期

（五）最適pH（六）Km的變化五、酶蛋白化學(xué)修飾的局限性1.某種修飾劑對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)修飾專一性是相對(duì)的，很少有對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈絕對(duì)專一的化學(xué)修飾劑。2.化學(xué)修飾后酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變，因此這種構(gòu)象的變化將妨礙對(duì)修飾結(jié)果的解釋。3.酶的化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行，目前還不能用化學(xué)修飾的方法研究非極性氨基酸殘基在酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系中的作用。4.酶化學(xué)修飾的結(jié)果對(duì)于研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系能提供一些信息，如某一氨基酸殘基被修飾后，酶活力完全喪失，說明該殘基是酶活性所“必需”的，為什么是必需的，還得用X射線和其他方法來確定。因此化學(xué)修飾法研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚缺乏準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性。非水酶學(xué)非水介質(zhì)中酶學(xué)基礎(chǔ)水是酶促反應(yīng)最常用的反應(yīng)介質(zhì)。但對(duì)于大多數(shù)有機(jī)化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。因?yàn)樵S多有機(jī)化合物(底物)在水介質(zhì)中難溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反應(yīng)的發(fā)生。是否存在非水介質(zhì)能保證酶催化？？早在20世紀(jì)初，Ｅ.Ｂourquelot等曾經(jīng)將乙醇、丙酮類的有機(jī)溶劑加到酶的水溶液中，進(jìn)行非水介質(zhì)中酶催化的嘗試。1966年，Price報(bào)道胰凝乳蛋白酶和辣根過氧化物酶在幾種有機(jī)溶劑中具有催化活性。非水介質(zhì)酶催化發(fā)展情況1975～1983年間Ｂ.Ｃ.Ｂuckland和Ｋ.Ｍartinek等做了將微生物細(xì)胞、游離酶和固定化酶用于有機(jī)溶劑中合成酯和類固醇及甾醇轉(zhuǎn)化的探索。1984年，克利巴諾夫（A.M.Klibanov）等人在Science上發(fā)表“EnzymaticCatalysisinOrganicMediaat100℃”此后十幾年來，酶在非水介質(zhì)中催化反應(yīng)的研究十分活躍。（一）氣相介質(zhì)中的酶催化酶在氣相介質(zhì)中進(jìn)行的催化反應(yīng)。適用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。由于氣體介質(zhì)的密度低，擴(kuò)散容易，因此酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點(diǎn)。酶非水相催化的幾種類型（二）超臨界流體介質(zhì)（supercriticalfluids）中的酶催化超臨界流體(

SupercriticalFluid,SCF)：溫度和壓力超過某物質(zhì)超臨界點(diǎn)的流體。

常見超臨界流體系：CO2(Tc=31℃，Pc=7.3atm)、H2O(Tc=374℃，Pc=218atm)、氨、甲醇、乙醇、乙烯....

對(duì)酶的結(jié)構(gòu)沒有破壞作用；對(duì)催化作用沒有明顯的不良影響；具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，對(duì)設(shè)備沒有腐蝕性；超臨界溫度不應(yīng)太高或太低；超臨界壓力不能太高；超臨界流體容易獲得，價(jià)格便宜。用于酶催化反應(yīng)的超臨界流體應(yīng)具備以下條件：酶在離子液中進(jìn)行的催化作用。離子液（ionicliquids）是由有機(jī)陽離子與有機(jī)（無機(jī)）陰離子構(gòu)成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點(diǎn)鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點(diǎn)。

（三）離子液（ionicliquids）介質(zhì)中的酶催化

有機(jī)介質(zhì)（organicsolvents)中的酶催化指酶在含有一定量水的有機(jī)溶劑中進(jìn)行的催化反應(yīng)。適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。酶在有機(jī)介質(zhì)中由于能夠基本保持其完整的結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，所以能發(fā)揮催化功能。酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性和熱穩(wěn)定性等都有所改變。（四）有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系

有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系幾種類型與水互溶的有機(jī)溶劑水單相體系非極性有機(jī)溶劑水兩相/多相體系非極性有機(jī)溶劑酶懸浮體系(微水介質(zhì)體系)非極性有機(jī)溶劑-PEG修飾酶單相體系反膠束體系膠束體系和反膠束體系

“水包油”和“油包水”表面活性劑：表面活性劑是由親水憎油的極性基團(tuán)和親油憎水的非極性基團(tuán)兩部分組成的兩性分子。在有機(jī)相酶反應(yīng)中用得最多的是陰離子表面活性劑：AOT(AerosolOT)，其化學(xué)名為丁二酸-2-乙基酯磺酸鈉。EEES水相E（正）膠束體系：表面活性劑的極性段朝外，非極性端朝內(nèi)，反應(yīng)時(shí)酶在膠束外面的水溶劑中，疏水性的底物或產(chǎn)物在膠束內(nèi)部。反應(yīng)在膠束的兩相界面進(jìn)行。反膠束體系：表面活性劑的極性端朝內(nèi)，非極性端朝外，水溶液包在膠束內(nèi)部。反應(yīng)時(shí)，酶分子在反膠束內(nèi)部的“小水池”中進(jìn)行催化。........有機(jī)相S膠束體系反膠束體系水相有機(jī)相酶在有機(jī)介質(zhì)中的性質(zhì)

酶在有機(jī)介質(zhì)中起催化作用時(shí)，由于有機(jī)溶劑的極性與水有很大差別，對(duì)酶的表面結(jié)構(gòu)、活性中心的結(jié)合部位和底物性質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生一定的影響，從而顯示出與水相介質(zhì)中不同的催化特性。熱穩(wěn)定性酶在有機(jī)介質(zhì)中的穩(wěn)定性變化儲(chǔ)存穩(wěn)定性酶介質(zhì)條件

熱穩(wěn)定性豬胰脂肪酶三丁酸甘油酯水，pH7.0T1/2<26hT1/2<2min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2=1.5hT1/2<2min枯草桿菌蛋白酶正辛烷，110℃T1/2=80min酸性磷酸酶正十六烷，80℃水，70℃T1/2=8minT1/2=1min腺苷三磷酸酶(F1-ATPase)甲苯，70℃水，60℃T1/2>24hT1/2<10min限制性核酸內(nèi)切酶（HindⅢ）正庚烷，55℃，30d活力不降低變性劑穩(wěn)定性脲、鹽酸胍-強(qiáng)變性劑破壞次級(jí)鍵、增加疏水性氨基酸的溶解度一般隨含水量降低而增加1.160.9100活力降低一半時(shí)鹽酸胍濃度溶劑體系的含水量不同含水量鹽酸胍對(duì)乳酸脫氫酶的變性作用3.22.02.23.8酶在有機(jī)介質(zhì)中的底物專一性、選擇性某些有機(jī)介質(zhì)可能使某些酶的專一性發(fā)生變化，這是酶活性中心構(gòu)象剛性增強(qiáng)的結(jié)果。有些在水中不能實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)途徑，在有機(jī)介質(zhì)中卻成為主導(dǎo)反應(yīng)。水溶液：疏水作用非水介質(zhì)：酶和底物結(jié)合的自由能；酶和水分子結(jié)合的自由能；底物在反應(yīng)介質(zhì)-酶活性中心的分配。相對(duì)專一性

對(duì)映體選擇性（enantioselectivity）又稱立體選擇性，是酶在對(duì)稱的外消旋化合物中識(shí)別一種異構(gòu)體的能力大小的指標(biāo)。（酶）合成產(chǎn)物溶劑合成收率枯草桿菌蛋白酶核糖核酸酶甘油90%50%無色桿菌蛋白酶胰島素乙醇30%80%凝血酶人生長素甘油80%20%反應(yīng)平衡方向的移動(dòng)有機(jī)介質(zhì)能改變某些酶催化的反應(yīng)平衡。例如：水解酶類（蛋白水解酶）在水介質(zhì)中，水的濃度為55.5mol/L，平衡趨向水解方向，在含水量極低的有機(jī)介質(zhì)中，平衡向合成方向偏移。有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)的影響因素水對(duì)有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的影響

有機(jī)介質(zhì)中的水含量多少對(duì)酶的空間構(gòu)象、酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性、酶的催化反應(yīng)速度等都有密切關(guān)系，水還與酶催化作用的底物和反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度有關(guān)。必需水（essentialwater）：維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量。例如：凝乳蛋白酶，只需５０分子的水。多酚氧化酶，需３５０個(gè)水分子。胰脂肪酶活性與含水量的關(guān)系反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑對(duì)酶催化反應(yīng)的影響常用的有機(jī)溶劑有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以較好地保持其完整的空間結(jié)構(gòu)。在有機(jī)溶劑中，酶分子不能直接溶解，而是懸浮在溶劑中進(jìn)行催化反應(yīng)。根據(jù)酶分子的特性和有機(jī)溶劑的特性的不同，保持其空間結(jié)構(gòu)完整性的情況也有所差別。

手性藥物的拆分有機(jī)介質(zhì)中酶催化的應(yīng)用手性藥物兩種對(duì)映體的藥理作用藥物名稱有效對(duì)映體的作用另一種對(duì)映體的作用心得安（Propranolol）萘普生（Neproxen）青霉素胺（Penicillamine）羥基苯哌嗪(Dropropizine)反應(yīng)停（Thalidomide）酮基布洛芬（Ketoprofen）喘速寧（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛爾（Kebivolol）S構(gòu)型，治療心臟病,β-受體阻斷劑S構(gòu)型，消炎、解熱、鎮(zhèn)痛S構(gòu)型，抗關(guān)節(jié)炎S構(gòu)型，鎮(zhèn)咳S構(gòu)型，鎮(zhèn)靜劑S構(gòu)型，消炎S構(gòu)型，擴(kuò)張支氣管S,S構(gòu)型，抗結(jié)核病右旋體，治療高血壓,β-受體阻斷劑R構(gòu)型，鈉通道阻滯劑R構(gòu)型，療效很弱R構(gòu)型，突變劑R構(gòu)型，有神經(jīng)毒性R構(gòu)型，致畸胎R構(gòu)型，防治牙周病R構(gòu)型，抑制血小板凝集R,R構(gòu)型，致失明左旋體，舒張血管沙利多胺(Thalidomide)*

酶分子定向進(jìn)化

Directedevolutionenzyme酶分子定向進(jìn)化酶分子定向進(jìn)化模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變和自然選擇）在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。酶的定向進(jìn)化酶分子的合理設(shè)計(jì)(rationaldesign)酶分子的定向進(jìn)化(directedevolution)酶的合理設(shè)計(jì)基因直接進(jìn)化的步驟突變基因突變庫的建立篩選

基因突變庫的活體或離體篩選基因復(fù)制與遺傳酶基因的體外隨機(jī)突變

易錯(cuò)PCR定義：從單一基因出發(fā)，通過改變PCR反應(yīng)條件，在基因擴(kuò)增過程中使堿基配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤而引起基因突變。過程：雙鏈DNA變性（解鏈；85－95℃）引物與單鏈DNA結(jié)合（退火；50－70℃）引物延伸（半保留復(fù)制；70－75℃）條件：增加Mg2＋（穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對(duì)）添加Mn2＋（降低聚合酶的特異性）4種底物的濃度不平衡（dATP/dTTP/dCTP/dGTP)

定向進(jìn)化的原理在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’→5’校對(duì)功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變文庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+定向選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用，整個(gè)進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的。DNA重排

定義：又稱為DNA改組技術(shù)，是從2種以上同源正突變基因出發(fā)，用酶（DNaseI）切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。原理：DNA片段互為模板和引物，進(jìn)行擴(kuò)增和延伸時(shí)堿基序列會(huì)重新排布而形成眾多的突變基因，分離出全長突變基因后再進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增以進(jìn)行定向選擇。

結(jié)果：將存在于不同基因中的多種正突變結(jié)合在一起。1994年，Stemmer等，用DNAShuffling技術(shù)體外快速進(jìn)化蛋白——有性PCR法1997年，F(xiàn)ranceAronld研究組將DNAShuffling技術(shù)做了改進(jìn)——交錯(cuò)延伸法DNA重組裝原理圖(DNAshuffling)1.DNaseI產(chǎn)生隨機(jī)片段；2.隨機(jī)片段變性；3.隨機(jī)片段復(fù)性；4.延伸反復(fù)重復(fù)2-4步后，可獲得全長DNA片段交錯(cuò)延伸PCR突變法隨機(jī)引物PCR和重組裝部分DNAShuffling技術(shù)的研究成果類型示例特性活性增加倍數(shù)潛在應(yīng)用領(lǐng)域蛋白綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度45基礎(chǔ)研究重組蛋白R(shí)ecA重組率100基礎(chǔ)研究抗體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化特異性10，000生物制藥β-內(nèi)酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65℃耐熱時(shí)間17200工業(yè)酶細(xì)胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥非同源改組二、酶突變基因的定向選擇定義：是在人工控制條件的特殊環(huán)境下，按照人們所設(shè)定的進(jìn)化方向?qū)ν蛔兓蜻M(jìn)行選擇，以獲得具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。過程：突變基因與適宜的載體進(jìn)行重組

組裝形成突變基因文庫（細(xì)胞或噬菌體）通過高通量篩選技術(shù)獲得目的基因目的基因表達(dá)獲得所需進(jìn)化酶突變基因的篩選根據(jù)定向進(jìn)化的目的設(shè)定定性選擇的環(huán)境條件高通量篩選技術(shù)

特點(diǎn)：通量大、效率高（短時(shí)間內(nèi)簡便地對(duì)大量突變進(jìn)行判斷）方法：平板篩選法熒光篩選法噬菌體表面展示法細(xì)胞表面展示法核糖體表面展示法定向進(jìn)化示意圖隨機(jī)突變+定向選擇＝目標(biāo)突變體細(xì)菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C最適生長溫度提高了！定向進(jìn)化的選擇策略1、定向進(jìn)化中，突變具有隨機(jī)性，但通過選擇特定方向的突變限定了進(jìn)化趨勢(shì)，加之控制實(shí)驗(yàn)條件，限定突變種類，降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進(jìn)化速度。2、通常，篩選方法必須靈敏，至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些直觀的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見光信號(hào)的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。3、選擇合適高通量的篩選體系。酶性質(zhì)突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機(jī)相活性/穩(wěn)定性易錯(cuò)PCRβ-內(nèi)酰胺酶總活力/底物專一性DNA改組枯草桿菌蛋白酶穩(wěn)定性盒式誘變對(duì)硝基苯酯酶底物專一性/有機(jī)相活性易錯(cuò)PCR/DNA改組

胸腺嘧啶核苷激酶底物專一性盒式誘變?chǔ)?半乳糖苷酶底物專一性DNA改組綠色熒光蛋白熒光DNA改組核酶底物專一性易錯(cuò)PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩(wěn)定性隨機(jī)/定位誘變藥物和疫苗活性/專一性/最佳表達(dá)DNA改組三、酶分子定向進(jìn)化的應(yīng)用1、提高酶的催化效率

2、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性枯草桿菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性的分子進(jìn)化（HuiminZhao等，1999）3、改變酶的底物特異性生物傳感器一、生物傳感器的概念生物傳感器:使用固定化的生物分子(immobilizedbiomolecules),與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)換能器結(jié)合，用于快速偵測(cè)物理、化學(xué)、生物量的新型器件。將分子識(shí)別元件中的生物敏感物質(zhì)與待測(cè)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),將反應(yīng)后所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化再通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)進(jìn)行測(cè)量,這種方式統(tǒng)稱為間接測(cè)量方式.二、生物傳感器的工作原理1生物分子特異性識(shí)別（生物感受器）

3信號(hào)轉(zhuǎn)換與處理2生物放大

通過生物放大原理可以大幅度提高分析測(cè)試的靈敏度。三、生物傳感器的分類1、酶?jìng)鞲衅?EnzymeSensor)它將活性物質(zhì)酶覆蓋在電極表面,酶與被測(cè)的有機(jī)物或無機(jī)物反應(yīng),形成一種能被電極響應(yīng)的物質(zhì)。例如,脲在尿素酶催化下發(fā)生反應(yīng)酶?jìng)鞲衅鞯奶攸c(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：酶易被分離，貯存較穩(wěn)定，所以目前被廣泛的應(yīng)用。缺點(diǎn)：1.酶的特異性不高，如它不能區(qū)分結(jié)構(gòu)上稍有差異的梭曼與沙林。2.酶在測(cè)試的過程中因被消耗而需要不斷的更換。微生物傳感器分為兩類：一類是利用微生物在同化底物時(shí)消耗氧的呼吸作用；另一類是利用不同的微生物含有不同的酶。好氧微生物在繁殖時(shí)需消耗大量的氧,可以氧濃度的變化來觀察微生物與底物的反應(yīng)情況。2、微生物傳感器(MicroorganismSensor)3.免疫傳感器抗體對(duì)相應(yīng)的抗原具有識(shí)別和結(jié)合的雙重功能,在與抗原結(jié)合時(shí),選擇性強(qiáng),靈敏度高，免疫傳感器就是利用其雙重功能將抗體或抗原和換能器組合而成的裝置。由于蛋白質(zhì)分子(抗體或抗原)攜帶有大量電荷、發(fā)色基團(tuán)等,當(dāng)抗原抗體結(jié)合時(shí),會(huì)產(chǎn)生電學(xué)、化學(xué)、光學(xué)等變化,通過適當(dāng)?shù)膫鞲衅骺蓹z測(cè)這些參數(shù),從而構(gòu)成不同的免疫傳感器，總的來說可分為兩類:(1)非標(biāo)記型;(2)標(biāo)記型依據(jù)生物體內(nèi)核苷酸順序相對(duì)穩(wěn)定,核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理而設(shè)計(jì)出核酸探針傳感器,即基因傳感器?；騻鞲衅饕话阌?0~30個(gè)核苷酸的單鏈核酸分子,能夠?qū)Ｒ坏嘏c特定靶序列進(jìn)行雜交從而檢測(cè)出特定的目標(biāo)核酸分子。根據(jù)換能器種類不同可分為電化學(xué)型、光學(xué)型、壓電免疫傳感器及表面等離子體共振型基因傳感器，這種傳感器可用于檢測(cè)食品中的病原體,為食品中病原體的鑒定提供了新的手段。4.DNA生物傳感器四、生物傳感器的應(yīng)用目前，生物傳感器應(yīng)用較多的領(lǐng)域是在醫(yī)療、醫(yī)藥、生物工程、環(huán)境保護(hù)、食品、農(nóng)業(yè)、畜牧等與生命科學(xué)關(guān)系密切的一些領(lǐng)域隨著社會(huì)的進(jìn)一步信息化，生物傳感器必將獲得越來越廣泛的應(yīng)用

抗體酶一.概念抗體酶或催化抗體（Catalyticantibody)是一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。二.抗