發(fā)酵工程第八章新演示文稿

發(fā)酵工程第八章新演示文稿當(dāng)前第1頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)優(yōu)選發(fā)酵工程第八章新當(dāng)前第2頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)本章內(nèi)容一、概述二、代謝調(diào)控在發(fā)酵過程控制中的應(yīng)用1.初級代謝物的生產(chǎn)調(diào)節(jié)2.次級代謝物的生產(chǎn)調(diào)節(jié)三、溫度對發(fā)酵的影響及其控制四、pH對發(fā)酵的影響及其控制五、溶解氧對發(fā)酵的影響及其控制六、CO2和呼吸商對發(fā)酵的影響及其控制七、基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響及補(bǔ)料控制八、泡沫對發(fā)酵的影響及其控制九、自動(dòng)控制技術(shù)在發(fā)酵過程控制中的應(yīng)用當(dāng)前第3頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)一、概述——1.

過程控制的重要性

過程控制的意義：最佳工藝條件的優(yōu)選（即最佳工藝參數(shù)的確定）以及在發(fā)酵過程中通過過程調(diào)節(jié)達(dá)到最適水平的控制。

決定發(fā)酵單位(水平)的因素外部環(huán)境因素工藝條件生物因素（菌株特性）設(shè)備性能（傳遞性能）物理：n、T、Ws化學(xué)：pH、DO、濃度營養(yǎng)要求生長速率呼吸強(qiáng)度產(chǎn)物合成速率當(dāng)前第4頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)一、概述——2.

發(fā)酵過程控制的一般步驟

確定能反映過程變化的各種理化參數(shù)及其檢測方法

研究這些參數(shù)的變化對發(fā)酵生產(chǎn)水平的影響及其機(jī)制，獲取最適水平或最佳范圍

建立數(shù)學(xué)模型定量描述各參數(shù)之間隨時(shí)間變化的關(guān)系

通過計(jì)算機(jī)實(shí)施在線自動(dòng)檢測和控制，驗(yàn)證各種控制模型的可行性及其適用范圍，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程最優(yōu)控制

當(dāng)前第5頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)一、概述——3.

參數(shù)檢測代謝參數(shù)按性質(zhì)可分為三類：物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量、溶解氧、表觀粘度、排氣氧（二氧化碳）濃度等化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、核酸量等生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌體濃度、菌體比生長速率、呼吸強(qiáng)度、攝氧率、關(guān)鍵酶活力等當(dāng)前第6頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)按獲取方式可分為兩類：

直接參數(shù)：如T、pH、罐壓、空氣流量、攪拌轉(zhuǎn)速、溶氧濃度等間接參數(shù)：將直接參數(shù)通過公式計(jì)算獲得的參數(shù)。如攝氧率(γ)、呼吸強(qiáng)度(QO2)、比生長速率（μ)、體積溶氧系數(shù)(KLa)、呼吸商(RQ)等。當(dāng)前第7頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)的測量形式離線測量：基質(zhì)（糖、脂類、無機(jī)鹽等）、前體和代謝產(chǎn)物（抗生素、酶、有機(jī)酸、氨基酸等）在線測量：如T、pH、DO、溶解CO2、尾氣CO2、黏度、攪拌轉(zhuǎn)速等優(yōu)點(diǎn)：及時(shí)、省力，可從繁瑣操作中解脫出來，便于計(jì)算機(jī)控制。困難：傳感器要求較高。當(dāng)前第8頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)對傳感器的要求能經(jīng)受高壓蒸汽滅菌；傳感器及其二次儀表具有長期穩(wěn)定性；最好能在過程中隨時(shí)校正，靈敏度好；探頭材料不易老化，使用壽命長；安裝使用和維修方便；解決探頭敏感部位被物料（反應(yīng)液）粘住、堵塞問題；價(jià)格合理，便于推廣。當(dāng)前第9頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法溫度測量

感溫元件：熱電偶（溫度信號→

電信號）二次儀表：將熱電偶輸出的電信號轉(zhuǎn)換成被測介質(zhì)的溫度當(dāng)前第10頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法攪拌轉(zhuǎn)速和攪拌功率的測量攪拌轉(zhuǎn)速：磁感應(yīng)式，光感應(yīng)式，測速電機(jī)；攪拌功率：功率表，測定力矩求功率法。當(dāng)前第11頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法空氣流量測定體積流量型：會(huì)引起流體能量損失，受溫度和壓力變化的影響；①同心孔板壓差式流量計(jì)；②轉(zhuǎn)子流量計(jì)。質(zhì)量流量型：根據(jù)流體固有性質(zhì)（質(zhì)量、導(dǎo)電性、熱傳導(dǎo)性能）設(shè)計(jì)的流量計(jì)。當(dāng)前第12頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法罐壓測量壓力表壓力傳感器

當(dāng)前第13頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法料液計(jì)量與液位控制壓差法：H=（△P2/△P1）·△H

直接重量測量法：直接稱重體積計(jì)量法：計(jì)算進(jìn)出料液流量計(jì)量法：計(jì)算流量和時(shí)間液位探針當(dāng)前第14頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)當(dāng)前第15頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法發(fā)酵液粘度測定毛細(xì)管粘度計(jì)回轉(zhuǎn)式粘度計(jì)渦輪旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)當(dāng)前第16頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法pH測量復(fù)合pH電極

pH測量儀器當(dāng)前第17頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法溶解氧的測量化學(xué)法極譜法復(fù)膜氧電極法

復(fù)膜氧電極示意圖（a）極譜型（b）原電池型當(dāng)前第18頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法溶解二氧化碳測量復(fù)膜式電極法滲透膜—碳酸氫鈉法發(fā)酵尾氣的在線分析

CO2分析

O2分析當(dāng)前第19頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)參數(shù)檢測方法細(xì)胞濃度的測量化學(xué)法：如DNA、RNA分析等

物理法：如重量分析、分光光度分析、濁度分析等新技術(shù)：以電容法為測量原理的在線活細(xì)胞濃度測量傳感器

原位活細(xì)胞在線檢測儀當(dāng)前第20頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)二、代謝調(diào)控在發(fā)酵過程控制中的應(yīng)用初級代謝物：指一類低分子量的終點(diǎn)產(chǎn)物及這些終點(diǎn)產(chǎn)物的生物合成途徑中的中間體。

(1)避開固有的反饋調(diào)節(jié)(2)

細(xì)胞通透性的變更1.

初級代謝物的生產(chǎn)調(diào)節(jié)當(dāng)前第21頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)反饋調(diào)節(jié)包括①反饋抑制：某一生物合成途徑的最終代謝物抑制該途徑的第一或第二個(gè)酶的活性。②反饋?zhàn)瓒簦阂种泼傅男纬桑怯赏緩浇K點(diǎn)產(chǎn)物或其衍生物施行的。（1）避開固有的反饋調(diào)節(jié)當(dāng)前第22頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)黃色短桿菌賴氨酸生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制1-天冬氨酸激酶；2-DDP合成酶；3-高絲氨酸脫氫酶；4-琥珀酰高絲氨酸合成酶；5-蘇氨酸脫氫酶當(dāng)前第23頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)方法限制菌在胞內(nèi)積累終點(diǎn)產(chǎn)物的能力以解除負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用從遺傳上改變酶的活性和酶的形成系統(tǒng)，篩選有抗反饋?zhàn)饔玫幕蛲蛔冃停▽Ψ答佔(zhàn)饔貌幻舾校?。具體應(yīng)用積累中間產(chǎn)物積累終點(diǎn)產(chǎn)物耐反饋?zhàn)饔玫耐蛔冎甑暮Y選：抗結(jié)構(gòu)類似物突變株

當(dāng)前第24頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)當(dāng)前第25頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)當(dāng)前第26頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選機(jī)制末端產(chǎn)物類似物和末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，因而能夠引起反饋?zhàn)饔?，但是它們不能參與生物合成。在培養(yǎng)基中添加末端產(chǎn)物類似物后，未突變的細(xì)胞將由于代謝途徑受阻而不能獲得生物合成所需的該種末端產(chǎn)物，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。那些對類似物不敏感的突變株仍能制造末端產(chǎn)物并長成菌落。

突變株耐結(jié)構(gòu)類似物的原因：①酶的結(jié)構(gòu)起了變化（指耐反饋抑制的突變株）②酶的合成系統(tǒng)起了變化（指耐反饋?zhàn)瓒舻耐蛔冎辏┊?dāng)前第27頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)雙突變株的概念：單一菌株內(nèi)同時(shí)發(fā)生耐反饋抑制和耐反饋?zhàn)瓒舻耐蛔冏饔?。思考題：某一菌株對所要生產(chǎn)的產(chǎn)物的類似物有天然的耐受力，這種時(shí)候能否利用類似物篩選突變株呢？回復(fù)篩選：用突變除去反饋敏感的酶和用第二次突變置換它，常產(chǎn)生分泌終點(diǎn)產(chǎn)物的回復(fù)子。當(dāng)前第28頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)細(xì)胞通透性的變更細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的增加是谷氨酸過量生產(chǎn)的原因之一。能過量生產(chǎn)谷氨酸的細(xì)菌有兩個(gè)共同特征：①

α-酮戊二酸脫氫酶缺失：表明這類細(xì)菌的TCA上的酶受阻，保證了碳引向谷氨酸的合成歧路。②

對生物素的營養(yǎng)需求：表明這類細(xì)菌的生物素的生物合成受阻，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的改變，使細(xì)胞可以分泌出谷氨酸。

當(dāng)前第29頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)2.

次級代謝物的生產(chǎn)調(diào)節(jié)(1)次級代謝的特點(diǎn)及與初級代謝的關(guān)系(2)

調(diào)節(jié)方法誘導(dǎo)作用避開固有的負(fù)反饋操縱環(huán)境條件來控制次級代謝物的生物合成耐負(fù)反饋調(diào)節(jié)的抗性突變株的篩選初級代謝物的調(diào)節(jié)作用能荷調(diào)節(jié)

e.g.磷酸鹽影響金霉素的合成

當(dāng)前第30頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）次級代謝的特點(diǎn)及與初級代謝的關(guān)系次級代謝酶的特異性較初級代謝酶的特異性低，故受遺傳及環(huán)境因素的影響大。次級代謝物的合成途徑比初級代謝的種類多，但大多數(shù)次級代謝物都是由少數(shù)關(guān)鍵中間代謝物組裝的。次級代謝產(chǎn)物的合成一般是在生長期后，即培養(yǎng)基中的養(yǎng)分快耗盡，菌的比生長速率降低時(shí)才合成。

當(dāng)前第31頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)操縱環(huán)境條件來控制次級代謝物的生物合成改變培養(yǎng)基成分來避免分解阻遏作用改變培養(yǎng)基成分來避免反饋抑制和阻遏作用

e.g.鏈霉素發(fā)酵中限制磷酸鹽的加量，避免其對參與生物合成的磷酸酯酶的反饋抑制和阻遏作用培養(yǎng)基中添加前體物來避免分支途徑終產(chǎn)物對發(fā)酵產(chǎn)品的間接抑制作用當(dāng)前第32頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)

分解阻遏作用的解除主要是在多個(gè)碳源中選擇慢碳源或者采用緩慢流加快碳源的工藝

在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中的青霉素發(fā)酵代謝曲線當(dāng)前第33頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)耐負(fù)反饋調(diào)節(jié)的抗性突變株的篩選篩選耐結(jié)構(gòu)類似物的突變株

e.g.

不需添加色氨酸的硝吡咯菌素的高產(chǎn)菌株回復(fù)篩選

e.g.高產(chǎn)金霉素產(chǎn)生菌篩選耐藥性菌株

e.g.利用抗生素篩選耐藥性菌株

當(dāng)前第34頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)當(dāng)前第35頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)(三)溫度對發(fā)酵的影響及其控制1.

影響發(fā)酵溫度的因素2.溫度對微生物生長的影響3.溫度對基質(zhì)消耗的影響4.溫度對產(chǎn)物合成的影響5.最適溫度的選擇與控制

當(dāng)前第36頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)1、影響發(fā)酵溫度的因素(1)發(fā)酵熱發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的熱量，叫做發(fā)酵熱。

Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q輻射

當(dāng)前第37頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)來源：微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的分解所釋放的能量影響因素：菌株培養(yǎng)基成分發(fā)酵時(shí)期

生物熱與其它參數(shù)的關(guān)系

①呼吸強(qiáng)度QO2②糖利用速率當(dāng)產(chǎn)生的生物熱達(dá)到高峰時(shí)，菌的呼吸強(qiáng)度最大，糖的利用速率也最大，可用耗氧量、糖耗來衡量生物熱。1、影響發(fā)酵溫度的因素(2)生物熱當(dāng)前第38頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)2.溫度對微生物生長的影響當(dāng)μ>>α?xí)r，α可忽略，微生物處于生長狀態(tài)。μ、α皆與T有關(guān)，其關(guān)系均可用阿累尼烏斯公式描述：∵Eμ＜Eα∴死亡速率比生長速率對溫度變化更為敏感

當(dāng)前第39頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)嗜冷、嗜中溫、嗜熱菌的典型生長與溫度關(guān)系當(dāng)前第40頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)2.溫度對微生物生長的影響(續(xù))在其最適溫度范圍內(nèi)，生長速率隨溫度升高而增加，當(dāng)溫度超過最適生長溫度，生長速率隨溫度增加而迅速下降。不同生長階段的微生物對溫度的反應(yīng)不同處于延遲期的細(xì)菌對溫度的影響十分敏感。對于對數(shù)生長期的細(xì)菌，如果在略低于最適溫度的條件下培養(yǎng)，即使在發(fā)酵過程中升溫，則升溫的破壞作用較弱。處于生長后期的細(xì)菌，其生長速度一般主要取決于溶解氧，而不是溫度。當(dāng)前第41頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)(1)糖比消耗速率qs

Righelato假定：m－維持因子，即生長速率為零時(shí)的葡萄糖的消耗。m項(xiàng)與滲透壓調(diào)節(jié)、代謝產(chǎn)物的生成、遷移性及除繁殖以外的其它生物轉(zhuǎn)化等過程所需的能量有關(guān)。這些過程受溫度的影響，所以m也和溫度相關(guān)。B－生長系數(shù)，即同一生長速率下的糖耗，B值越大，說明同樣比生長速率下，用于純粹生長的糖耗越大。改變溫度可以控制qs和μ

當(dāng)前第42頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（2）T對B、m和μ的影響

qs一定：當(dāng)T<Tm時(shí)，m↑，μ↑,B↓

底物轉(zhuǎn)化效率高

當(dāng)T>Tm時(shí)，m↓，μ↓,B↑

底物轉(zhuǎn)化效率低 當(dāng)T=Tm時(shí)，T(K)m溫度對B、m和不同qs下對μ值的影響當(dāng)前第43頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)4.溫度對產(chǎn)物合成的影響影響發(fā)酵過程中各種反應(yīng)速率，從而影響微生物的生長代謝與產(chǎn)物生成。

e.g.青霉菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素青霉菌生長活化能E1=34kJ/mol

青霉素合成活化能E2=112kJ/mol

∴青霉素合成速率對溫度較敏感當(dāng)前第44頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，間接影響菌的生物合成。影響生物合成方向。

e.g.四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌：T<30℃，產(chǎn)生金霉素；T達(dá)35℃，產(chǎn)生四環(huán)素；谷氨酸發(fā)酵中擴(kuò)展短桿菌：30℃培養(yǎng)后37℃發(fā)酵，積累過量乳酸。

溫度對菌的調(diào)節(jié)機(jī)制關(guān)系密切。4.溫度對產(chǎn)物合成的影響當(dāng)前第45頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)4.溫度對產(chǎn)物合成的影響影響酶系組成及酶的特性。米曲霉制曲：溫度控制在低限，有利于蛋白酶合成凝結(jié)芽孢桿菌的α-淀粉酶熱穩(wěn)定性：55℃培養(yǎng)→90℃保持60min，剩留活性為88%~99%；35℃培養(yǎng)→經(jīng)相同條件處理，剩余活性僅有6%~10%。當(dāng)前第46頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)5.最適溫度的選擇與控制定義：最適溫度是指在該溫度下最適于菌的生長或產(chǎn)物的生成，它是一種相對概念，是在一定條件下測得的結(jié)果。二階段發(fā)酵

e.g.青霉素發(fā)酵：菌體生長期,30℃

青霉素合成分泌期,20℃當(dāng)前第47頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)最適溫度的選擇還要參考其它發(fā)酵條件靈活掌握通氣條件較差情況下，最適發(fā)酵溫度可能比正常良好通氣條件下低一些。培養(yǎng)基成分和濃度的影響當(dāng)前第48頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)變溫培養(yǎng)：在抗生素發(fā)酵過程中采用變溫培養(yǎng)比用恒溫培養(yǎng)所獲得的產(chǎn)物有較大幅度的提高。

e.g.四環(huán)素發(fā)酵：0~30h稍高溫度→30~150h稍低溫度→150h后升溫發(fā)酵青霉素發(fā)酵：30℃,5h→25℃,35h→20℃,85h

→25℃,40h；產(chǎn)量提高14.7％當(dāng)前第49頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（四）pH對發(fā)酵的影響及其控制1.

發(fā)酵對pH的影響2.pH值對發(fā)酵過程的影響3.最適pH的選擇4.發(fā)酵過程中pH的調(diào)節(jié)與控制當(dāng)前第50頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)1）發(fā)酵液中pH變化的基本原理微生物代謝對pH影響主要在兩種情況下發(fā)生：①酸性或堿性代謝產(chǎn)物的生成或釋放；②菌體對培養(yǎng)基中生理酸性或堿性物質(zhì)的利用。引起發(fā)酵液中pH下降的因素（1）C/N過高，或中間補(bǔ)糖過多，溶氧不足，致使有機(jī)酸積累，pH下降；（2）消泡劑加得過多：脂肪酸增加；（3）生理酸性鹽的利用；（4）酸性產(chǎn)物形成：如有機(jī)酸發(fā)酵。

當(dāng)前第51頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)引起發(fā)酵液中pH上升的因素（1）C/N過低（N源過多），氨基氮（NH4＋）釋放；（2）中間補(bǔ)料中氨水或尿素等堿性物質(zhì)加入過多；（3）生理堿性鹽的利用；（4）堿性產(chǎn)物形成。當(dāng)前第52頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)

2）發(fā)酵過程中pH的變化規(guī)律生長階段：pH相對于起始pH有上升或下降的趨勢生產(chǎn)階段：pH趨于穩(wěn)定，維持在最適于產(chǎn)物合成的范圍自溶階段：pH又上升

當(dāng)前第53頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）pH對微生物生長的影響每一類菌都有其最適pH和能耐受的pH范圍細(xì)菌:pH6.3～7.5；霉菌和酵母菌：pH3～6；

放線菌：pH7～8控制一定的pH值，不僅保證微生物生長，而且防止雜菌感染e.g.石油代臘酵母：

pH3.5～5.0：生長良好且不易染菌

pH>5.0：酵母形態(tài)變小，發(fā)酵液變黑，且污染大量細(xì)菌

pH<3.0：酵母生長受抑制，細(xì)胞極不整齊，且出現(xiàn)自溶

當(dāng)前第54頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)pH對生長的影響機(jī)制對E合成的影響對E活性的影響對ATP生產(chǎn)率影響：影響菌體細(xì)胞膜電荷狀況，引起膜的滲透性的變化，因而影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。影響培養(yǎng)基某些重要營養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的離解，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用

當(dāng)前第55頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)

（2）pH對產(chǎn)物合成的影響產(chǎn)物合成階段的最適pH值和微生物生長階段的最適pH往往不一定相同，這不僅與菌種特性有關(guān)，還取決于產(chǎn)物的化學(xué)特性。

e.g.丙酮丁醇菌：生長

pH為5.5～7.0；合成pH為4.3～5.3

青霉素產(chǎn)生菌：生長pH為6.5～7.2，合成pH為6.2～6.8

鏈霉素產(chǎn)生菌：生長pH為6.3～6.9，合成pH為6.7～7.3

當(dāng)前第56頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)pH影響代謝方向：pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。

e.g.黑曲霉發(fā)酵：pH2~3,檸檬酸；pH接近中性，草酸酵母菌發(fā)酵：pH4.5~5.0，酒精；pH8.0，酒精、醋酸和甘油谷氨酸發(fā)酵：pH7.0~8.0，谷氨酸；pH5.0~5.8,谷酰胺和N-乙酰谷酰胺當(dāng)前第57頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)pH對青霉素發(fā)酵的影響：在不同pH范圍內(nèi)加糖，青霉素產(chǎn)量和糖耗不一樣。pH范圍

糖耗殘?zhí)?/p>

青霉素相對單位pH6.0～6.3加糖

10%0.5%較高pH6.6～6.9加糖

7%0.2%高pH7.3～7.6加糖

7%>0.5%低pH6.8控制加糖

<7%<0.2%最高速率恒定(0.055%/h)*采用pH控制補(bǔ)糖速率的意義當(dāng)前第58頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)3.最適pH的選擇

選擇pH準(zhǔn)則：獲得最大比生產(chǎn)速率和合適的菌體量，以獲得最高產(chǎn)量。pH對產(chǎn)海藻酸裂解酶的影響配制不同初始pH的培養(yǎng)基，搖瓶考察發(fā)酵情況當(dāng)前第59頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）pH調(diào)節(jié)方法

配制合適的培養(yǎng)基，有很好的緩沖能力；發(fā)酵過程中加入非營養(yǎng)基質(zhì)的酸堿調(diào)節(jié)劑

(NaOH、HCl、CaCO3)；發(fā)酵過程中加入生理酸性或堿性基質(zhì)，通過代謝調(diào)節(jié)pH；

酸性基質(zhì)：銨鹽、糖、油脂、玉米漿(脫NH4＋)

堿性基質(zhì)：NO3－鹽、有機(jī)酸鹽、有機(jī)氮、氨水、尿素原則:①殘?zhí)歉邥r(shí)，不用糖調(diào)pH

②殘N高時(shí)，不用生理鹽調(diào)pHpH控制與代謝調(diào)節(jié)結(jié)合起來，通過補(bǔ)料來控制pH當(dāng)前第60頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（2）pH控制方法比較以青霉素發(fā)酵為例，最適pH為6.6～6.9控制方案：方案一：培養(yǎng)基中供應(yīng)充足的糖，并配用pH緩沖劑方案二：培養(yǎng)基中供應(yīng)充足的糖，以非基質(zhì)NaOH調(diào)節(jié)pH方案三：在發(fā)酵過程中恒速補(bǔ)糖，以NaOH、H2SO4調(diào)節(jié)pH方案四：改變補(bǔ)糖速率來控制pH為6.6～6.9當(dāng)前第61頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)

（3）pH控制系統(tǒng)

執(zhí)行單元調(diào)節(jié)器pH變選器給定值補(bǔ)料pH電極mA4~20mA當(dāng)前第62頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（五）溶解氧對發(fā)酵的影響及其控制1.

引起溶解氧變化的因素2.溶解氧對發(fā)酵的影響3.

溶解氧在發(fā)酵過程控制中的重要作用4.發(fā)酵液中溶解氧的控制5.溶解氧控制實(shí)例當(dāng)前第63頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）影響溶解氧（DO）的因素

供氧

耗氧兩大類以關(guān)系式表示：影響供氧的因素：影響耗氧的因素：

C*-CL溫度、溶質(zhì)、溶劑、氧分壓KLa設(shè)備參數(shù)、操作參數(shù)、發(fā)酵液特性菌種特性、培養(yǎng)基成分和濃度、菌齡、培養(yǎng)條件（T、pH）、代謝類型γ當(dāng)前第64頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（2）發(fā)酵過程中溶氧變化規(guī)律批式發(fā)酵無DO控制情況下，溶氧變化規(guī)律為“波谷現(xiàn)象”溶氧、x、QO2、隨時(shí)間變化的關(guān)系

CLxQO2當(dāng)前第65頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)平衡點(diǎn)分析：①當(dāng)CL↑，即，OTR>γ∵，∴OTR逐漸↓至OTR=γ，即，高位平衡當(dāng)處于高位平衡時(shí)，表明供氧性能好。高位平衡通常發(fā)生在正常情況的前、后期。當(dāng)前第66頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)平衡點(diǎn)分析：②當(dāng)CL↓（如對數(shù)生長期γ很大），，OTR<γ∵，∴，，稱低位平衡。低位平衡通常發(fā)生在正常情況下的對數(shù)期。

當(dāng)前第67頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)值得注意的幾點(diǎn)自然“波谷現(xiàn)象”，一般可以自適應(yīng)調(diào)節(jié)（）當(dāng)，則需要控制，增加OTR，防止需氧受阻。補(bǔ)料與“波谷現(xiàn)象”對應(yīng)：即補(bǔ)料時(shí)間、劑量選擇與溶氧變化有關(guān)。

a.

不能在波谷時(shí)補(bǔ)料，加重缺氧

b.

一次補(bǔ)料不能過量，防止，菌體停止呼吸、死亡

c.每次補(bǔ)料都會(huì)引起一次大的溶氧下降。當(dāng)前第68頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)

（1）溶解氧對生長的影響臨界氧濃度（CCr）：

當(dāng)時(shí),當(dāng)時(shí),∴對生長應(yīng)滿足,但并不是越高越好呼吸抑制呼吸不受抑制指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度。當(dāng)前第69頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（2）溶解氧對產(chǎn)物合成的影響

最適氧濃度（Cm）：溶氧濃度對產(chǎn)物合成有一個(gè)最適范圍，CL過高或過低，對合成都不利。

e.g.卷須霉素：12~70h之間，維持CL在10%比在0或45%的產(chǎn)量要高。

當(dāng)前第70頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（3）CCr與Cm比較：通常Cm與CCr不一致對于某些菌株

Ccr>Cm,卷須霉素:

而有些菌株

Ccr<Cm,頭孢菌素C：Cm8%Ccr13~23%Ccr

5%Cm

10~20%當(dāng)前第71頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)QO2(QO2)mCcrCLPCmCL生長階段要求CL>CCr，生產(chǎn)階段滿足CL≥Cm。

當(dāng)前第72頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）發(fā)酵異常指標(biāo)發(fā)酵中污染雜菌，溶解氧發(fā)生異常變化。對于好氣性雜菌，溶解氧會(huì)一反往常在較短時(shí)間內(nèi)跌到零附近，跌零后長時(shí)間不回升。對于厭氣性雜菌，溶解氧升高。污染噬菌體或其它不明原因引起發(fā)酵液變稀，此時(shí)溶解氧迅速上升。操作故障或事故分析

當(dāng)前第73頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)谷氨酸正常發(fā)酵和異常發(fā)酵的溶解氧曲線——正常發(fā)酵溶解氧曲線-----異常發(fā)酵溶解氧曲線—·—異常發(fā)酵光密度曲線當(dāng)前第74頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（2）補(bǔ)料控制指標(biāo)

中間補(bǔ)料是否得當(dāng)可以從溶解氧的變化看出。發(fā)酵過程中出現(xiàn)“發(fā)酸”現(xiàn)象，此時(shí)溶解氧很快下降。

當(dāng)前第75頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（3）代謝方向控制指標(biāo)

測量溶解氧可以確定CCr、Cm值通過溶氧測量可以掌握由好氣轉(zhuǎn)為厭氣培養(yǎng)的關(guān)鍵時(shí)機(jī)

e.g.天門冬酰胺酶發(fā)酵：45%飽和度

在酵母以及其他微生物菌體的生產(chǎn)中，溶氧值是控制其代謝方向的最好的指標(biāo)之一。當(dāng)前第76頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（4）設(shè)備性能、工藝合理性指標(biāo)評價(jià)設(shè)備性能、工藝合理性的最終指標(biāo)：發(fā)酵單位

設(shè)備反映供氧性能：攪拌槳形式

葉片形式

攪拌器直徑d

攪拌檔數(shù)m和攪拌器間距s

檔板寬度w和檔板數(shù)z

通氣：空氣分布器的類型和位置

n，P/V

設(shè)備操作參數(shù)

罐壓

WS或VVM攪拌設(shè)備幾何參數(shù)當(dāng)前第77頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（4）設(shè)備性能、工藝合理性指標(biāo)工藝條件反映耗氧和供氧特征菌種性能：耗O2培養(yǎng)基性能：耗O2、供O2溫度：耗O2、供O2RQ（O2與CO2水平比較）：耗O2表面活性劑：耗O2、供O2當(dāng)前第78頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)改進(jìn)工藝：控制補(bǔ)料速度、T

的調(diào)節(jié)、中間補(bǔ)水、添加表面活性劑等等

對現(xiàn)有發(fā)酵工廠進(jìn)行技術(shù)改造

淺層次

修改設(shè)備和工藝

規(guī)模和控制水平上檔次

引入新型發(fā)酵類型

深層次

當(dāng)前第79頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)

工藝的改進(jìn)是否有效可通過溶解氧水平進(jìn)行評價(jià)：

P/V的改變對溶解氧和產(chǎn)量的影響

e.g.利福霉素發(fā)酵：50~80h波谷階段，P/V↑，KLa↑，供氧↑；3W/L比1W/L批號的發(fā)酵單位增加約900u/ml

攪拌轉(zhuǎn)數(shù)n對溶解氧和產(chǎn)量的影響e.g.赤霉素發(fā)酵：15~50h期間，n從155提高至180r/min，

赤霉素單位↑當(dāng)前第80頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）溶解氧控制的一般原則

生長階段：即可產(chǎn)物合成階段：即可過高的溶氧水平反而對菌體代謝有不可逆的抑制作用當(dāng)前第81頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（2）溶解氧控制作為發(fā)酵中間控制的手段之一

控制原理發(fā)酵過程中，糖量↑→x↑,QO2↑

→

γ

↑

→

CL↓

糖量

↓→QO2↓→γ↓→

CL↑

補(bǔ)糖使CL下降，而CL回升的快慢取決于供氧效率。對于一個(gè)具體的發(fā)酵，存在一個(gè)最適氧濃度（Cm）水平，補(bǔ)糖速率應(yīng)與其相適應(yīng)。

，加大補(bǔ)糖速率

，減小補(bǔ)糖速率實(shí)現(xiàn)用溶解氧水平控制補(bǔ)料速率

當(dāng)前第82頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)

補(bǔ)糖速率控制在正好使生產(chǎn)菌處于所謂“半饑餓狀態(tài)”，使其僅能維持正常的生長代謝，即把更多的糖用于產(chǎn)物合成，并永遠(yuǎn)不超過罐設(shè)計(jì)時(shí)的KLa水平所能提供的最大供氧速率。

控制原則（2）溶氧控制作為發(fā)酵中間控制的手段之一

當(dāng)前第83頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)控制方法

溶氧和補(bǔ)糖控制系統(tǒng)

溶氧和pH控制的系統(tǒng)

當(dāng)前第84頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)溶氧在加糖控制上的應(yīng)用當(dāng)前第85頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)溶氧與pH協(xié)同控制系統(tǒng)當(dāng)前第86頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（3）溶解氧控制的工藝方法：從供氧、需氧兩方面考慮

供氧方面：提高氧分壓（氧分含量），即，提高供氧能力改變攪拌轉(zhuǎn)速：通過改變KLa來提高供氧能力

通氣速率Ws↑：Ws增加有上限，引起“過載”、泡沫提高罐壓：

，但同時(shí)會(huì)增加CO2的溶解度，影響pH及可能會(huì)影響菌的代謝，另外還會(huì)增加對設(shè)備的強(qiáng)度要求。

當(dāng)前第87頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)改變發(fā)酵液理化性質(zhì)（σ，，Ii）

加消泡劑，補(bǔ)加無菌水，改變培養(yǎng)基成分→改變KL改變溫度：，提高推動(dòng)力（C*－CL）（3）溶解氧控制的工藝方法（續(xù)）

供氧方面：當(dāng)前第88頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（3）溶解氧控制的工藝方法（續(xù)）耗氧方面

限制性基質(zhì)的流加控制（補(bǔ)料控制）：在OTR一定情況下，控制基質(zhì)濃度→限制μ、x→

限制γ→控制溶解氧當(dāng)前第89頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（4）溶解氧自動(dòng)控制系統(tǒng)改變通氣速率的溶氧控制系統(tǒng)

改變攪拌轉(zhuǎn)速的溶氧控制系統(tǒng)改變通氣量、轉(zhuǎn)速、罐壓所組成的多參數(shù)溶氧控制系統(tǒng)

當(dāng)前第90頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)溶解氧對被孢霉合成花生四烯酸

(AA)的影響

溶氧量對AA產(chǎn)量的影響注：搖床轉(zhuǎn)速150r/min,25℃

KLa越大，培養(yǎng)基中溶解氧越多,

AA合成速度越快當(dāng)前第91頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)溶解氧控制對鳥苷產(chǎn)量的影響不同的DO控制條件下鳥苷積累的比較DO(％)：◆—5，■—l0，▲—20，×—30發(fā)酵過程DO

變化與鳥苷積累的關(guān)系DO控制在10~20％，產(chǎn)物積累↑，鳥苷含量最高。DO在5％和30％，前期產(chǎn)物積累↑，但后期基本不增加.DO水平的超高階段(發(fā)酵周期28h～44h)，鳥苷積累量基本不增加；調(diào)整DO在適當(dāng)水平上，鳥苷積累量繼續(xù)上升。

當(dāng)前第92頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（六）CO2和呼吸商對發(fā)酵的影響及其控制1.

定義2.發(fā)酵過程中CO2釋放率的變化3.

CO2對發(fā)酵的影響

當(dāng)前第93頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)1.定義

呼吸商（RQ）：指菌體呼吸過程中，CO2釋放率和菌的耗氧速率之比，RQ反映菌的代謝情況。菌體耗氧速率

OUR，molO2/L·h

菌體CO2釋放率CER，molCO2/L·h當(dāng)前第94頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）影響尾氣中CO2濃度的因素

通入空氣量：

呼吸強(qiáng)度：CO2溶解度：菌體量：當(dāng)前第95頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（2）CER變化規(guī)律

CO2積累量漸增，與x曲線對應(yīng)，基本類似S型曲線變化；當(dāng)工藝和設(shè)備參數(shù)一定的情況下，CER與x有比例關(guān)系（CER∝菌體生長速率）；CO2濃度變化與O2濃度變化成反向同步關(guān)系。當(dāng)前第96頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)∫[CER]dt，菌體干重的時(shí)間曲線1-[CER]dt；2-菌量當(dāng)前第97頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（3）CER的測量與計(jì)算

測量方法：熱導(dǎo)、紅外分析儀、質(zhì)譜儀計(jì)算

當(dāng)前第98頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）研究參數(shù)CO2的意義

作為代謝產(chǎn)物或中間前體，尾氣中CO2積累與生物量成正比，通過C質(zhì)量平衡估算生長速率和細(xì)胞量。高濃度CO2對發(fā)酵多表現(xiàn)為抑制作用，應(yīng)實(shí)施測量與控制；尾氣CO2不僅直接反映代謝情況，而且和其它參數(shù)及補(bǔ)料操作密切相關(guān)，可作為工藝優(yōu)化的指標(biāo)。當(dāng)前第99頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（2）CO2對細(xì)胞的作用機(jī)制“麻醉”作用

CO2及HCO3-都會(huì)影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使膜的流動(dòng)性及表面電荷密度發(fā)生變化，導(dǎo)致許多基質(zhì)的跨膜運(yùn)輸受阻，影響了細(xì)胞膜的運(yùn)輸效率，使細(xì)胞處于“麻醉”狀態(tài)，細(xì)胞生長受到抑制，形態(tài)發(fā)生改變。

當(dāng)前第100頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（3）CO2對菌體生長及產(chǎn)物形成的影響

CO2↑,基質(zhì)分解速率↓，ATP↓

，中間產(chǎn)物↓或形態(tài)變異導(dǎo)致產(chǎn)量↓高濃度CO2抑制作用的獨(dú)立性:只要CO2在培養(yǎng)液中濃度過量，即使供氧充足（CL>CCr），CO2的抑制作用不能解除，這種負(fù)作用在放大過程更明顯。正確評價(jià)通氣的作用：供氧：排廢氣：水分及揮發(fā)性組分的散失

當(dāng)前第101頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（4）CO2釋放與發(fā)酵過程參數(shù)pH及操作參數(shù)補(bǔ)糖速率的關(guān)系在青霉素發(fā)酵中補(bǔ)糖將引起排氣CO2增加，同時(shí)pH下降。

糖、CO2、pH三者的相關(guān)性，被青霉素工業(yè)生產(chǎn)上用于補(bǔ)料控制的參數(shù)，并認(rèn)為排氣CO2的變化比pH變化更為敏感，所以測定排氣CO2釋放率（CER）來控制補(bǔ)糖速率。

補(bǔ)糖與溶氧及pH協(xié)同控制補(bǔ)糖速率與CER控制

當(dāng)前第102頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)補(bǔ)糖對排氣CO2和pH的影響當(dāng)前第103頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（4）尾氣CO2與O2的相關(guān)性

相關(guān)程度表示：尾氣CO2與O2相關(guān)性：反向同步關(guān)系呼吸商（RQ）與發(fā)酵的關(guān)系不同菌株、同一菌株不同代謝途徑、同一菌株利用不同基質(zhì)、同一菌株在不同發(fā)酵階段，RQ值不相同。RQ值可以表征發(fā)酵狀況。

當(dāng)前第104頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)青霉素發(fā)酵不同階段：

菌體生長階段：RQ＝0.909

維持階段：RQ=1

生產(chǎn)階段：RQ=4如果產(chǎn)物的還原性比基質(zhì)大時(shí)，其RQ值就增加；反之，當(dāng)產(chǎn)物的氧化性比基質(zhì)大時(shí)，RQ值就要減少，其偏離程度決定于單位菌體利用基質(zhì)形成產(chǎn)物的量。產(chǎn)物形成對RQ影響最大當(dāng)前第105頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（七）基質(zhì)濃度對發(fā)酵過程的影響及補(bǔ)料控制1.基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響

2.補(bǔ)料控制當(dāng)前第106頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）

基質(zhì)濃度對微生物生長的影響s<<KS情況下，比生長速率與基質(zhì)濃度呈直線關(guān)系：一般情況下符合Monod方程式基質(zhì)濃度高時(shí)

當(dāng)前第107頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)當(dāng)前第108頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)(2)基質(zhì)濃度對產(chǎn)物合成的影響低濃度限制低水平誘導(dǎo)高濃度抑制及分解阻遏作用e.g.葡萄糖氧化酶發(fā)酵：葡萄糖用量從8%降至6%，補(bǔ)入2%氨基乙酸或甘油，使酶活力分別提高26%或6.7%。

谷氨酸發(fā)酵（乙醇為碳源）：當(dāng)乙醇濃度為2.5g/L和35g/L時(shí)，可延長谷氨酸生產(chǎn)時(shí)間，但在更高濃度下，菌體生長受到抑制，谷氨酸產(chǎn)量降低。當(dāng)前第109頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（1）補(bǔ)料的目的解除基質(zhì)過濃的抑制解除產(chǎn)物的反饋抑制解除分解代謝物阻遏作用避免因一次性投糖過多造成細(xì)胞大量生長，耗氧過多而造成波谷現(xiàn)象。在生產(chǎn)上，補(bǔ)料還經(jīng)常作為糾正異常發(fā)酵的一個(gè)重要手段。當(dāng)前第110頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（2）補(bǔ)料的內(nèi)容

補(bǔ)充微生物能源和碳源補(bǔ)充菌體所需要的氮源補(bǔ)充微量元素或無機(jī)鹽添加前體、誘導(dǎo)劑等當(dāng)前第111頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（3）補(bǔ)料的原則中間補(bǔ)料的數(shù)量為基礎(chǔ)料的1～3倍。補(bǔ)料的原則就在于控制微生物的中間代謝，使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向發(fā)展?，F(xiàn)有的各種補(bǔ)料措施都是通過實(shí)驗(yàn)方法確定的。

當(dāng)前第112頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)大多數(shù)補(bǔ)料分批發(fā)酵均補(bǔ)加生長限制性基質(zhì)以經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)或預(yù)測數(shù)據(jù)控制流加；用傳感器直接測定限制性基質(zhì)的濃度，直接控制流加；以溶氧、pH、RQ、排氣中CO2分壓及代謝物質(zhì)濃度等參數(shù)間接控制流加；以物料平衡方程，通過傳感器在線測定的一些參數(shù)計(jì)算限制性基質(zhì)的濃度，間接控制流加。（4）補(bǔ)料控制的策略當(dāng)前第113頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（5）反饋控制參數(shù)的確定為了有效地進(jìn)行中間補(bǔ)料，必須選擇恰當(dāng)?shù)姆答伩刂茀?shù)，以及了解這些參數(shù)與微生物代謝、菌體生長、基質(zhì)利用以及產(chǎn)物形成之間的關(guān)系。

e.g.谷氨酸發(fā)酵

在谷氨酸發(fā)酵過程中的某階段，生產(chǎn)菌的攝氧率和基質(zhì)消耗速率之間存在著線性關(guān)系。當(dāng)前第114頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)K=1.51K=1.75K=2.16谷氨酸發(fā)酵中K值對糖濃度的控制的影響當(dāng)前第115頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（6）補(bǔ)料速率的確定優(yōu)化補(bǔ)料速率是補(bǔ)料控制中十分重要的一環(huán)，補(bǔ)料速率要根據(jù)微生物對營養(yǎng)等的消耗速率及所設(shè)定的培養(yǎng)液中最低維持濃度而定。補(bǔ)糖速率最佳點(diǎn)與設(shè)備的供氧能力有關(guān)。

e.g.青霉素發(fā)酵：KLa大的設(shè)備補(bǔ)料速率相應(yīng)大些；供氧低的設(shè)備，補(bǔ)料速率相應(yīng)減少，產(chǎn)量比供氧能力好的設(shè)備降低23％。當(dāng)前第116頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)（7）實(shí)例：四環(huán)素發(fā)酵中的補(bǔ)糖控制補(bǔ)糖時(shí)間對四環(huán)素發(fā)酵單位的影響Ⅰ－補(bǔ)糖時(shí)間適當(dāng)（45h后加）Ⅱ－補(bǔ)糖時(shí)間過晚（62h開始加）Ⅲ－補(bǔ)糖時(shí)間過早（20h后加）當(dāng)前第117頁\共有132頁\編于星期六\2點(diǎn)

維持不同還原糖水平的四環(huán)素