高效液相色譜技術(shù)在食品營養(yǎng)中的應(yīng)用

高效液相色譜技術(shù)在食品營養(yǎng)中的應(yīng)用第一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜技術(shù)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。

高效液相色譜法定義：第二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二溶于流動(dòng)相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法

高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。原理及應(yīng)用領(lǐng)域：第三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二①高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。②高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。③高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng,進(jìn)樣量在μL數(shù)量級(jí)。④應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。

高效液相色譜法特點(diǎn)————“三高一廣一快”⑤分析速度快、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。第四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二●高效液相色譜法主要類型：

液固吸附色譜1液液分配色譜2凝膠色譜4鍵合相色譜3第五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二一.液固吸附色譜

1.1分離原理液固色譜是基于各組分吸附能力的差異進(jìn)行混合物分離的，其固定相是固體吸附劑。

1.2固定相吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類。1.3流動(dòng)相流動(dòng)相要求：

①選用的溶劑應(yīng)當(dāng)與固定相互不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性

②選用的溶劑應(yīng)有高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中積累，引起柱性能的改變。

③選用的溶劑性能應(yīng)與所使用的檢測器相匹配，如果使用紫外吸收檢測器，就不能選用在檢測波長下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測器，就不能用梯度洗脫。目錄第六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二市場價(jià)格：11000RMB/噸純度99%以上，含氮量高達(dá)66%純牛奶的蛋白質(zhì)含量約為2.9%左右，而一般蛋白質(zhì)含氮量16%。在檢出三聚氰胺的產(chǎn)品中，石家莊三鹿牌嬰幼兒配方奶粉三聚氰胺含量很高，其中最高的達(dá)2563mg/kg，其他在0.09-619mg/kg之間。第七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二第八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二二、保健食品中主要功效成分的檢測方法及原理第九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二第十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二傳統(tǒng)測蛋白質(zhì)的方法—?jiǎng)P氏定氮法是根據(jù)測定樣品中的含氮量來計(jì)算其中的蛋白質(zhì)的含量：含氮量×6.256.25為蛋白質(zhì)的含氮系數(shù)三聚氰胺事件發(fā)生的原因：(1)檢測方法的局限性！(2)利益的趨勢！(3)科學(xué)普及的不足性！第十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二HPLC法檢測功效成分的原理和方法第十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二●高效液相色譜法的特點(diǎn):熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。高壓高效高速高沸點(diǎn)第十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二流程及主要部件1.流程第十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二2.主要部件

主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性(1)高壓輸液泵第十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二(2)梯度淋洗裝置外梯度:利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二(3)進(jìn)樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：第十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二(4)液相色譜檢測器

a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。

特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。第十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二b.光電二極管陣列檢測器

紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第十九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二光電二極管陣列檢測器第二十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二c.示差折光檢測器

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；第二十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二d.熒光檢測器對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；

高靈敏度！高選擇性！第二十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二Ⅱ高效液相色譜法(HPLC)檢測青蒿素含量一．實(shí)驗(yàn)原理

HPLC原理：利用樣品分子在固定相（填料柱）和流動(dòng)相之間相互作用力大小不同而實(shí)現(xiàn)分離。高壓可提高溶質(zhì)組分移動(dòng)速度。按溶質(zhì)組分與固定相之間的作用機(jī)理分類：①吸附分配作用：反相、正相和疏水性色譜；②電荷作用：不同類型的離子交換色譜；③空間排阻作用：凝膠過濾和凝膠滲透色譜；④生物特異性作用：親和色譜。第二十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二流動(dòng)相——極性溶劑酸性、低離子強(qiáng)度水溶液，加入一定比例的能與水互溶的有機(jī)改性劑，如乙腈、甲醇、異丙醇等有機(jī)溶劑

；

固定相——非極性填料孔徑30納米以上的烷基鍵合硅膠填料：短鏈烷基（如C4、C8和苯基）；長鏈烷基（如C18、C22）烷基的鏈越長，固定相的疏水性越強(qiáng)，流動(dòng)相中加入與水互溶的有機(jī)溶劑，以提高洗脫速度。反相高效液相色譜（RP-HPLC）機(jī)理：利用溶質(zhì)組分與固定相間疏水作用力不同而分離。第二十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二流動(dòng)相——極性溶劑；固定相——非極性填料組分性質(zhì)作用力固定相流動(dòng)相移動(dòng)速度保留時(shí)間A組分B組分非極性強(qiáng)非極性弱大小小大

慢長

快短青蒿素堿性溶液定量生成α?β—不飽和酮酸鹽

酸化穩(wěn)定的化合物，在260nm處有吸收峰，可用高效液相色譜紫外法檢測。第二十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二二.操作方法溶液配制：1．0.2%NaOH溶液500ml：稱取1.00gNaOH去離子水溶解

500ml；2．0.08mol/L醋酸溶液：

吸取冰醋酸2.30ml去離子水500ml

3．0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4pH7.0緩沖液（流動(dòng)相）：稱取Na2HPO4·12H2O固體1.79g蒸餾水500ml稱取NaH2PO4·12H2O固體0.68g蒸餾水500ml混合，調(diào)pH7.04.

1.00mg/ml青蒿素標(biāo)準(zhǔn)液：精確稱取50.0mg青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品無水乙醇

50ml（容量瓶）5.樣品液：分別精確稱取青蒿素粗品50、100、150mg于10ml具塞試管中無水乙醇5ml超聲波振蕩促溶→轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中

無水乙醇10ml第二十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二流動(dòng)相處理:微濾器（膜孔0.22μm）

pH7.0磷酸緩沖液

超聲波振蕩器脫氣15min

HPLC進(jìn)樣器第二十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二10ml具塞試管進(jìn)樣液制備：樣品液(標(biāo)準(zhǔn)液)1.00ml

0.2%NaOH溶液4.00ml

45℃水浴反應(yīng)30min

冷水浴冷卻至室溫

0.08mol/L醋酸5.00ml

針頭微濾器(0.2μm)注射器吸進(jìn)樣液1ml第二十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二恒流泵A恒流泵B紫外檢測儀A液水相B液有機(jī)相LC-100液相色譜儀

進(jìn)樣器色譜柱第二十九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二液相色譜儀的啟動(dòng)順序：打開排空閥，抽出流動(dòng)相，排除空氣打開高壓泵和檢測器的電源開關(guān)，檢測器自動(dòng)開始自檢啟動(dòng)電腦；插入U(xiǎn)盤，軟件自動(dòng)初始化；設(shè)置波長。

設(shè)置總流量、A和B兩液的比例、泵壓、啟動(dòng)泵。設(shè)置自動(dòng)停止時(shí)間、各項(xiàng)屏顯參數(shù)、文件名及保存路徑。

先通入流動(dòng)相沖洗管路系統(tǒng)，基線走直后，進(jìn)樣20μl

第三十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二HPLC的圖形結(jié)果色譜圖(Chromatogram):色譜柱流出物通過檢測器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度,橫坐標(biāo)為時(shí)間←色譜峰時(shí)間(分)基線↓峰高峰寬響應(yīng)值第三十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二液相色譜圖名詞術(shù)語(1)色譜圖名詞術(shù)語:色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過檢測器時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)峰底(Pea