LH20裝填和使用說明

經(jīng)典word整理文檔，僅參考，轉(zhuǎn)Word此處可刪除頁眉頁腳。本資料屬于網(wǎng)絡(luò)整理，如有侵權(quán)，請聯(lián)系刪除，謝謝！SephadexLH-20裝填指南葡聚糖凝膠SephadexLH-20使用說明同SephadexLH20使用心得談：123第2洗45）））5Sephadex－20分離黃酮類化合物經(jīng)驗）。生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理和化學(xué)特性，然后通過實驗選擇出最有效的純化流程。1.測定分子量、PI當(dāng)目標(biāo)蛋白的物理特性如分子量、PIPAGE電泳方法或?qū)游龇椒右詼y定。分離范圍廣闊的SuperoseHR預(yù)裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質(zhì)在多個含不同PH緩沖液的試管中，可簡易地測出PI，并選擇純化用緩沖液的最佳PH。2.選擇層析方法若對目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：一]使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如SuperoseSephacrylHR依據(jù)分子量將樣品分成不同組份。二]物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。一步即可得到高純度樣品。三]體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。3.純化大量粗品sepharosebigsepharoseXLsepharosefastflow等大顆粒離子交換介質(zhì)。擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)利用多種STREAMLINE介質(zhì)，直接從含破碎細(xì)胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。提高回收率，縮短純化周期。4.純化硫酸氨樣品硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品，經(jīng)處理過的樣本處于高鹽狀態(tài)下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用SephadexG-25脫鹽。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。利用HitrapHICTestKit和RESOURCEHICTestKit可在八種疏水介質(zhì)中選擇最適合介質(zhì)及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。5.純水糖類分子固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結(jié)合碳水化合物的糖類殘基，很適Sepharose6MB親和層析介質(zhì)，專為俘獲整個細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。6.純化膜蛋白在作離子交換時和目標(biāo)蛋白競爭交換介質(zhì)，籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。7.純化單抗、抗原*單抗多為。來源主要是腹水和融合瘤培養(yǎng)上清液。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。MabselectProteinG和ProteinA對IgG的FcIgG。血清互補(bǔ)劑如小牛血清可先用蛋白GA介質(zhì)Mabselect和rProteinASepharoseFF對IgGrProteinA用離子交換QSepharoseHP或凝膠過濾Superdex200，很容易去除。*疏水層析PhenylSepharoseHP亦很適合純化IgG。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex200在精細(xì)純化中去除。*純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如CNBr、NHsactivatedSepharoseFF偶聯(lián)IgG，再進(jìn)一步獲取IgG抗原。*HiTrapIgM是用來純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗5mgHiTrapIgY是專門用來純化，結(jié)合量達(dá)100mg純。8.純化重組蛋白重組蛋白在設(shè)計、構(gòu)建時應(yīng)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或溶解產(chǎn)物，擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)STREAMLINE便很適合做粗分離。Amershambiosciences統(tǒng)。一]GST融合載體使要表達(dá)的蛋白和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用GlutathioneSepharose4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。2．蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgGSepharose6FF純化。二]Histidine-tagged）的融合蛋白可用ChelatingSepharoseFF螯合Ni2+金屬，在8MHisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。9.純化包涵體蛋白包涵體蛋白往往需溶于6M鹽酸胍或8MSuperose12及Sepharose6FFSuperdex75、QSepharoseFF和PhenylSepharoseFF分別被發(fā)現(xiàn)有助包涵體蛋白的復(fù)性。一般包涵體蛋白樣品SOURCE30RPC1MnaOH重生。此方法純化后的包涵體蛋白，復(fù)性回收率明顯提高。10.包涵體蛋白固相復(fù)性近年許多文獻(xiàn)報導(dǎo)將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上，一般用各種SepharoseFF離子交換層析介質(zhì)。去除變性劑后，蛋白在介質(zhì)上成功復(fù)性，再將復(fù)性好的蛋白洗脫下來。固相復(fù)性避免了一般復(fù)性過程中蛋白質(zhì)聚體的形成，所以復(fù)性得率更高，而且無需大量稀釋樣品，并將復(fù)性和初純化合二為一，大大節(jié)省時間及提高回收率。固相復(fù)性方法也被用于以HiTrapChelating金屬螯合層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的組氨酸融合蛋白；以HiTrapHeparin肝素親和層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預(yù)裝柱均可反復(fù)多次重復(fù)使用，比一般試劑盒更方便、耐用。11.純化中草藥有效成分中藥的化學(xué)成分極其復(fù)雜。傳統(tǒng)中藥多是煎熬后服用，有效成份多較為親水，包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸、多糖、肽和蛋白質(zhì)。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。SephadexLH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能，例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨后，最后是甙元。SephadexLH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內(nèi)脂、萜類、甾類等。生物堿在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrapSP陽離子交換層析柱可以分離許多結(jié)構(gòu)非常HiTrapQ陰離子交換柱上分離效果良好。一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex，Sephacryl。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可選擇新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、堿溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進(jìn)一步獲各組份純品。另外，多糖藥物需去除可引起過敏的蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)Sevag方法用丁醇脫蛋白需反復(fù)數(shù)十次。陰陽離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質(zhì)。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復(fù)雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14，并可用1M1MHCL清洗、再生。比傳統(tǒng)硅膠反相層析更易于工藝優(yōu)化及在位清洗，壽命也更長。12.純化肽類肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機(jī)溶劑或促溶劑中復(fù)性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCESOURCESOURCE5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。SuperdexPeptideHR是專為肽分子純化設(shè)計的凝膠過濾預(yù)裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex30PG。13.純化核酸、病毒核酸的純化用于去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和PCRDNASephacryS-1000SF、Superose或Sepharoce4FF凝膠過濾介質(zhì)去除雜蛋白，再配合離子交換如MonoQ、SOURCEQ分離核酸。14.純化寡核苷酸寡酸苷酸多應(yīng)用在反義(anti-sense)DNARNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的MonoQ或快速低反壓的SOURCEQ在PH12下可除副產(chǎn)物，并避免凝集和保護(hù)基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。15.脫鹽、小分子去除使用凝膠過濾介質(zhì)Sephadex，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達(dá)床體積30%。只需在進(jìn)樣后收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡單直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整個過程一般可于數(shù)分鐘至半小時完成。SephadexG25系列介質(zhì)專為蛋白質(zhì)脫鹽而設(shè)計，預(yù)裝柱HiTrap（5mlHiPrepDesalting(26ml)可在數(shù)分鐘為多至10ml樣品脫鹽。16.疫苗純化使用凝膠過濾介質(zhì)Sepharose4FF10%。柱高一般40-70cm，整個過程約半至一小時。目前使用此法生產(chǎn)的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結(jié)核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用SephacrylS-500HR，如甲肝疫苗等。17.抗生素聚合物分析中國藥典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產(chǎn)品的白分比，規(guī)定使用SephadexG10凝膠過濾法測定。18.純化-基因治療用病毒載體SORRCE15Q19.純化-基因治療用質(zhì)粒QSepharose，SOURCE，STREAMLINEQ，SephacrylS500，Plasmidselect在下游純化中,可應(yīng)用不同層析技術(shù)在純化生物分子的同時,去除各種污染物。1.去除——內(nèi)毒素內(nèi)毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負(fù)電的復(fù)合大分子。內(nèi)毒素的脂肪A部份有很強(qiáng)的疏水性。但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒（17-1349-01）可選擇結(jié)合目標(biāo)蛋白的介質(zhì)而去除內(nèi)毒素。內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAESepharoseFastFlow有較強(qiáng)結(jié)合?？稍谙疵撃繕?biāo)蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除。利用CNBr或NHSSepharoseFF可偶聯(lián)內(nèi)毒素底物如，，自動成親合層析介質(zhì)結(jié)合內(nèi)毒素。內(nèi)毒素經(jīng)常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除。2.去除——蛋白中的核酸大量核酸增加樣本黏度，令區(qū)帶擴(kuò)張，反壓增加，降低分辨率和流速。藥審和食檢對核酸含量也有嚴(yán)格限制。胞內(nèi)表達(dá)蛋白的核酸問題尤其嚴(yán)重。核酸帶陰電荷，在初步純化時利用陽離子交換介質(zhì)如STREAMLINESP，SPSepharoseBigBeads,SP或CMSepharoseFF,SPSepharoseXL結(jié)合目標(biāo)蛋白，可除去大量核酸。核酸在高鹽下會和蛋白解離,疏水層析介質(zhì)很適合用來結(jié)合目標(biāo)蛋白,在純化蛋白的同時去除核酸。利用核酸酶將核酸切成小片斷,用凝膠過濾做精細(xì)純化時便很容易去除了。3.去除——病毒和微生物病毒和微生物可成為病原應(yīng)盡量減除。結(jié)合不同層析技術(shù)，使用注射用水，用NaOH定期進(jìn)行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。病毒大都有脂外殼。可用與目標(biāo)蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent)處理，使病毒失活，如Triton和。再用適當(dāng)?shù)碾x子交換介質(zhì)如CMSepharoseFF結(jié)合目標(biāo)蛋白，去除。其它污染物可以改變pHSuperdex及多種吸附性介質(zhì)，SOURCE都是很好的精細(xì)純化介質(zhì),可去除多種微量污染物。紹凝膠層析的理論（分子篩理論），重點介紹Sephadex葡聚糖凝膠層析方法和試驗。gelfiltration）技術(shù)是60年代興起的一種簡便有效的生物分離純化方法。當(dāng)混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，因凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排阻于外部，在或者稱為凝膠層析。凝膠是不溶于水，在水中卻有較大膨脹度和較好的分子篩功能的一類化合物。目前主要有葡聚糖凝SephadexSapharoseBio-Gel其后還發(fā)展了凝膠的各種衍生物，如羧甲基-交聯(lián)葡聚糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基-交聯(lián)葡聚糖（DEAE-Sephadex）等種類。由于凝膠過濾技術(shù)設(shè)備簡單、操作方便，重復(fù)性能好和樣品得率高等特點。廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，如蛋白質(zhì)、核酸、多糖氨基酸、激素和抗生素等物質(zhì)的分離純化。凝膠層析在載脂蛋白的分離純化中，屬于使用最多的技術(shù)手段。凝膠過濾裝置種類很多，其基本操作過程大同小異，操作步驟主要有：①凝膠種類的選擇，按被分離物的性質(zhì)及分子量大小而定；②凝膠柱的制備；③加樣與洗脫；④分部收集透析，濃縮。一、基本理論（一）分子篩效益一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時，各分子在柱內(nèi)同時進(jìn)行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴(kuò)散運動。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動的過程中，從一個凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會有三種情況，一是分子很小，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，完全不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動距離較短，分子較小的移動距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小排隊，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。（二）色譜柱的重要參數(shù)⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt表示。⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。⑶內(nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。不包括固體支持物的體積（Vg）。Ve少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時，洗脫體積計算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。二、凝膠的種類及性質(zhì)⑴SephadexG交聯(lián)葡聚糖的商品名為SephndexG表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。⑵Sephadex─Sephadex-25的羧丙基衍生物，商品名很多，常見的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美國Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。（三）聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P（Bio-Gel），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號很多，從P-2至P-300共10P后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。（四）聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel，具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量1600到，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜。三、實驗技術(shù)（一）層析柱層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。（二）凝膠的選擇根據(jù)所需凝膠體積，估計所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量為201克SephadexG─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質(zhì)采用100-200號篩目的的SephadexG-200效果好，脫鹽用Sephadex、G-50，用粗粒，短柱，流速快。（三）凝膠的制備商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時，自然膨脹需24小時至數(shù)天，而用加熱法在幾小時內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。SephadexG-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4％，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。（五）防止微生物的污染交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:⑴疊氨鈉（NaN3）在凝膠層析中只要用0.02％疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20℃時約為％；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02最佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時易引起分解而失效。⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0.01％。在微酸性溶液中最為⑷苯基汞代鹽在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01％。在微堿性溶液中抑效果最佳，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。選擇層析方法SuperoseSephacrylHR根據(jù)分子量將樣品分成不同組份。二、用含專一配體或抗體的親和層析介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白。也可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標(biāo)蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。一部即可得到高純度樣品。三、大體積的樣品、常使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。脫鹽、小分子去除使用凝膠過濾介質(zhì)SephadexG10、G15、G25、G50等去除小分子，效率高，處理量可達(dá)床體積30%。只需在進(jìn)樣后收集1/3-1/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡單直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整個過程一般可于數(shù)分鐘至半小時完成。SephadexG25HiTrapDesalting(5ml)可用針筒操作。HiTrapDesalting(26ml)可在數(shù)分鐘為多至10ml樣品脫鹽。:zhouchao2006發(fā)布日期:2008-03-15如何選擇凝膠做分離純化工作的人都知道，選擇合適的填料是至關(guān)重要的。1.測定分子量、PI當(dāng)目標(biāo)蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時，可用PAGESuperoseHR預(yù)裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質(zhì)在多個含不同PH緩沖液的試管中，可簡易地測出PI，并選擇純化用緩沖液的最佳PH。2.選擇層析方法若對目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：一]使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如Superose、SephacrylHR依據(jù)分子量將樣品分成不同組份。二]得到高純度樣品。三]直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。3.純化大量粗品處理大量原液時，為避免堵塞柱子，一般使用sepharosebigbeads、sepharoseXL、sepharosefastflow等大顆粒離子交換介質(zhì)。擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)利用多種STREAMLINE介質(zhì)，直接從含破碎細(xì)胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。提高回收率，縮短純化周期。4.純化硫酸氨樣品SephadexG-25脫鹽。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。利用HitrapHICTestKit和RESOURCEHICTestKit可在八種疏水介質(zhì)中選擇最適合介質(zhì)及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。5.純水糖類分子固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可Sepharose6MB親和層析介質(zhì)，專為俘獲整個細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。6.純化膜蛋白此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。7.純化單抗、抗原*單抗多為IgG。來源主要是腹水和融合瘤培養(yǎng)上清液。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。Mabselect、ProteinG和ProteinA對IgG的Fc區(qū)有專一性親和作用，能一步純化各種不同源的IgG。血清互補(bǔ)劑如小牛血清可先用蛋白G預(yù)處理，在培養(yǎng)前除去IgG。重組蛋白A介質(zhì)Mabselect和rProteinASepharoseFF對IgG有更高的載量和專一性，基團(tuán)脫落更少。脫落的rProteinA用離子交換QSepharoseHP或凝膠過濾Superdex200，很容易去除。*疏水層析PhenylSepharoseHP亦很適合純化IgG。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex200在精細(xì)純化中去除。*純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如CNBr、NHsactivatedSepharoseFF偶聯(lián)IgG，再進(jìn)一步獲取IgG抗原。*HiTrapIgM是用來純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達(dá)5mgIgM。HiTrapIgY是專門用來純化IgY，結(jié)合量達(dá)100mg純IgY。8.純化重組蛋白細(xì)胞或溶解產(chǎn)物，擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)STREAMLINE便很適合做粗分離。Amershambiosciences提供三個快速表達(dá)、一步純化的融合系統(tǒng)。一]GST融合載體使要表達(dá)的蛋白和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用GlutathioneSepharose4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。2．蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgGSepharose6FF純化。二]含組氨酸標(biāo)記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用ChelatingSepharoseFF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。9.純化包涵體蛋白包涵體蛋白往往需溶于6M鹽酸胍或8M尿素中。高化學(xué)穩(wěn)定性的Superose12及Sepharose6FF凝膠過濾介質(zhì)很適合在變性條件下做純化。變性純化后的蛋白需要復(fù)性至蛋白的天然構(gòu)象。Superdex75、QSepharoseFF和PhenylSepharoseFF分別被發(fā)現(xiàn)有助包涵體蛋白的復(fù)性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高，復(fù)性效果越好。SOURCE30RPC反相層析介質(zhì)很適合純化復(fù)性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法純化后的包涵體蛋白，復(fù)性回收率明顯提高。10.包涵體蛋白固相復(fù)性*近年許多文獻(xiàn)報導(dǎo)將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上，一般用各種SepharoseFF離子交換層析介質(zhì)。去除變性劑后，蛋白在純化合二為一，大大節(jié)省時間及提高回收率。*固相復(fù)性方法也被用于以HiTrapChelating金屬螯合層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的組氨酸融合蛋白；以HiTrapHeparin肝素親和層析直均可反復(fù)多次重復(fù)使用，比一般試劑盒更方便、耐用。11.純化中草藥有效成分效成份多較為親水，包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸、多糖、肽和蛋白質(zhì)。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。SephadexLH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能，例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨后，最后是甙元。SephadexLH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內(nèi)脂、萜類、甾類等。*生物堿在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrapSP陽離子交換層析柱可以分離許多結(jié)構(gòu)非常近似的生物堿。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸等可溶于偏堿的緩沖液中，在HiTrapQ陰離子交換柱上分離效果良好。*一般多糖純化大多使用分子篩如在600KD以下，并需更高分辨率，可選擇新一代的Superdex。一般植物可能含Sevag方法用蛋白質(zhì)。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測、分反相層析可用范圍為PH1-14，并可用1MNaOH，1MHCL清洗、再生。比傳統(tǒng)硅膠反相層析更易于工藝優(yōu)化及在位清洗，壽命也更長。12.純化肽類肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機(jī)溶劑或促溶劑中復(fù)性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE30RPC、SOURCE15RPC、SOURCE5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。SuperdexPeptideHR是專為肽分子純化設(shè)計的凝膠過濾預(yù)裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex30PG。13.純化核酸、病毒核酸的純化用于去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和PCR產(chǎn)物等。病毒也可視作核酸大分子，和質(zhì)粒DNASephacryS-1000或Sepharoce4FF凝膠過濾介質(zhì)去除雜蛋白，再配合離子交換如MonoQ、SOURCEQ分離核酸。14.純化寡核苷酸和cDNAMonoQ或快速低反壓的SOURCEQ在PH12下可除副產(chǎn)物，并避免凝集和保護(hù)基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。15.脫鹽、小分子去除使用凝膠過濾介質(zhì)Sephadex等去除小分子，效率高，處理量可達(dá)床體積30%。只需在進(jìn)樣后收集首1/3-1/2柱體積去除小分子，柱高