細(xì)胞自噬與腫瘤課件

細(xì)胞自噬與腫瘤1整理版ppt一、自噬簡介

二、自噬研究方法

三、自噬與腫瘤的關(guān)系

目錄2整理版ppt一、自噬簡介1.1自噬過程(1)在饑餓、氧化應(yīng)激損傷等情況下，自噬體膜脫落形成杯狀分隔膜，包繞在被降解物周圍；

(2)分隔膜逐漸延伸，將要被降解的胞漿成分完全包繞形成雙層膜自噬體；

(3)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成分，自噬體膜脫落再循環(huán)利用。

3整理版ppt自噬過程

2.1自噬的功能：（1）對外源性刺激的適應(yīng)性反應(yīng)；（2）細(xì)胞保持穩(wěn)定狀態(tài)的管家機(jī)制；（3）參與一定的組織特異性融合；（4）作為一種細(xì)胞死亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞主動性死亡。4整理版ppt自噬發(fā)生過程的分子機(jī)制

5整理版ppt自噬的研究方法

目前普遍采用的自噬檢測方法包括電鏡、免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡等方法檢測自噬體及其標(biāo)志蛋白。準(zhǔn)確評估自噬不僅包括自噬體的檢測，還包括動態(tài)觀察整個自噬性降解的過程是否順暢(即自噬潮分析)。另外，通過藥物或基因干預(yù)技術(shù)來人為地調(diào)控自噬以觀察其在體內(nèi)體外模型中的作用也是自噬分析的重要內(nèi)容。

任何一種方法單獨(dú)應(yīng)用均不能作為自噬的依據(jù)，不能將自噬體的增多減少或自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的高低等同于自噬的增強(qiáng)或減弱[1]。6整理版ppt1、自噬性結(jié)構(gòu)的電鏡下形態(tài)學(xué)觀察

透射電子顯微鏡是觀察自噬現(xiàn)象的最直接、最經(jīng)典的方法。電鏡檢測自噬主要是基于辨認(rèn)自噬體結(jié)構(gòu)。

電鏡觀察僅能證明自噬性結(jié)構(gòu)的存在，難以反映自噬活性的強(qiáng)弱。Swanlund等[2]介紹了一種免疫金電鏡技術(shù)來對電鏡結(jié)果進(jìn)行定量分析。通過圖像分析軟件自動測量所有自噬囊泡的面積(μm2)，如果一個細(xì)胞胞漿中被自噬性囊泡所占據(jù)的總面積增加，則可說明自噬機(jī)制的上調(diào)。7整理版ppt8整理版ppt2、基于自噬體標(biāo)記蛋白LC3的檢測方法

自噬過程由一系列自噬相關(guān)蛋白(Atg蛋白)介導(dǎo)完成，這些蛋白質(zhì)在自噬體形成的不同階段發(fā)揮作用.。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。當(dāng)自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(PE)偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記。9整理版ppt2.1、

細(xì)胞免疫熒光LC3-Ⅰ在胞漿內(nèi)彌散分布，LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上，通過免疫熒光的方法檢測內(nèi)源性LC3或轉(zhuǎn)染GFP-LC3融合蛋白的表達(dá)，自噬誘導(dǎo)后的細(xì)胞表現(xiàn)為點(diǎn)狀聚集增多。理論上，觀察到的點(diǎn)狀聚集的數(shù)目即為自噬體的數(shù)量，根據(jù)點(diǎn)狀聚集的密集程度可以判斷細(xì)胞自噬的情況。但是這種方法僅從總體上大致反映自噬的增加或減少，定量分析則存在局限性。10整理版ppt

GFP-LC3單熒光自噬指示體系：

綠色斑點(diǎn)增多也并不一定代表自噬活性增強(qiáng)，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻，可以通過westernblot檢測游離的GFP、p62來驗(yàn)證。11整理版ppt2.2、LC3蛋白轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)自噬發(fā)生后，通過Western-blot可以檢測到兩個條帶的蛋白質(zhì)。由于在自噬時細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白總的表達(dá)水平其實(shí)并無上調(diào)，僅僅是一部分LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變成了LC3-Ⅱ，那么理論上自噬時應(yīng)表現(xiàn)為LC3-Ⅰ的減少和LC3-Ⅱ的增加，通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或者LC3-Ⅱ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)即可反映自噬水平。12整理版ppt

但是由于二者對抗體結(jié)合能力的差異導(dǎo)致檢測敏感性的不同(LC3-Ⅱ檢測敏感性高于LC3-Ⅰ)，實(shí)際檢測結(jié)果LC3-Ⅰ的減少并不與LC3-Ⅱ的增加同步，因此單純比較LC3-Ⅱ蛋白的水平可能更好。13整理版ppt3、

基于自噬性降解的檢測———“自噬潮”分析自噬過程是動態(tài)變化的，想要說明細(xì)胞自噬活性的強(qiáng)弱，必須通觀整個自噬的過程是否順利，即通過基于自噬性降解的自噬潮分析來進(jìn)一步說明自噬活性。

自噬潮涵蓋了自噬體的形成、自噬性底物向溶酶體的運(yùn)送以及在溶酶體內(nèi)降解的整個過程。顯然，對這整個過程進(jìn)行監(jiān)測比單純自噬體檢測更能反映自噬活性，因此“自噬潮”分析是反映自噬活性的可靠指標(biāo)。14整理版ppt3.1、長壽命蛋白降解根據(jù)自噬機(jī)制主要負(fù)責(zé)降解長壽命蛋白的特性，先讓細(xì)胞在含有同位素標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中生長一段時間，細(xì)胞在此期間合成的蛋白質(zhì)都將被同位素標(biāo)記，然后換成不含同位素的培養(yǎng)基，讓一些被標(biāo)記的短壽命蛋白通過蛋白酶體途徑降解。

在自噬誘導(dǎo)后，通過檢測培養(yǎng)基上清中釋放的自噬性降解產(chǎn)物的放射性活度即可反映細(xì)胞自噬性降解的能力。15整理版ppt3.2、LC3和其他自噬性底物的降解自噬過程中，自噬體內(nèi)膜上的LC3-Ⅱ被溶酶體降解，通過免疫印跡監(jiān)測自噬過程中LC3蛋白量的變化或流式細(xì)胞儀監(jiān)測GFP-LC3熒光強(qiáng)度的變化即可反映自噬活性。在自噬誘導(dǎo)一開始，GFP-LC3點(diǎn)狀聚集顯著增多，隨后信號可能會出現(xiàn)下降，代表著自噬性降解的發(fā)生。16整理版ppt3.3、mRFP-GFP-LC3的溶酶體呈遞mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬指示體系：17整理版ppt3.4、GFP-LC3切割LC3連同自噬體內(nèi)膜和內(nèi)容物一起被溶酶體降解，但GFP在溶酶體中僅表現(xiàn)熒光信號猝滅，GFP本身并不被降解，在自噬性溶酶體降解后會釋放出游離的GFP。

通過免疫印跡的方法檢測游離GFP蛋白的出現(xiàn)即意味著自噬性降解的發(fā)生。18整理版ppt4、自噬的實(shí)驗(yàn)性調(diào)控通過人為的干預(yù)來激活或者抑制自噬功能后觀察細(xì)胞行為或效應(yīng)分子的變化能夠使研究結(jié)論更具有說服力。目前，實(shí)驗(yàn)性激活或者抑制自噬的方法有藥物處理、自噬基因敲除、沉默或過表達(dá)。

常用的自噬激活劑：雷他霉素、營養(yǎng)缺乏、Lithum

常用的自噬抑制劑：3-MA、氯化銨、BafilomycinA119整理版ppt自噬與腫瘤的關(guān)系自噬在腫瘤治療中有雙重作用：作為腫瘤抑制機(jī)制，自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡、限制細(xì)胞數(shù)量，或者減少DNA的突變概率，以防止腫瘤形成；作為腫瘤保護(hù)機(jī)制，自噬可以保護(hù)癌細(xì)胞免受化療藥物的作用并延緩腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。

自噬可以抑制腫瘤，例如葡萄籽原花青素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡[4]，硅膠納米顆粒通過活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及自噬性死亡[5]。另外，有研究顯示，在多種應(yīng)激狀況下，自噬可以提高細(xì)胞存活[6]。例如，腫瘤進(jìn)展造成局部缺氧和營養(yǎng)匱乏，此時自噬水平升高以增加腫瘤細(xì)胞存活[7]。20整理版ppt參考文獻(xiàn)[1]馬泰,孫國平,李家斌.細(xì)胞自噬的研究方法[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2012,39(3):204-209.[2]ChenN,Karantza-WadsworthV.Roleandregulationofautophagyincancer[J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-MolecularCellResearch,2009,1793(9):1516-1523.[3]石文沽,劉凱,陳德喜,等.自噬與肝癌[J].北京醫(yī)學(xué),2011,33(12).[4]王威,陳景紅,王新寧,等.葡萄籽原花青素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及自噬性死亡[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版),2011,32(2).[5]SharmaV,AndersonD,DhawanA.ZincoxidenanoparticlesinduceoxidativeDNAdamageandROS-triggeredmitochondriamediatedapoptosisinhumanlivercells(HepG2)[J].Apoptosis,2012,17(8):852-870.[6]KroemerG,Mari?oG,LevineB.Autophagyandtheintegratedstressresponse[J].Molecularcell,2010,