蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

當(dāng)前第1頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)蛋白質(zhì)是食品的重要營養(yǎng)成分當(dāng)前第2頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)

蛋白質(zhì)在食品加工中的意義

Theimportanceofproteininfoodprocessing

蛋白質(zhì)是食品中三大營養(yǎng)素之一

蛋白質(zhì)對食品的色、香、味及組織結(jié)構(gòu)等具有重要意義

一些蛋白質(zhì)具有生物活功能，是開發(fā)功能性食品原料之一

當(dāng)前第3頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)蛋白質(zhì)的元素組成TheelementsofproteinC：50-55%H：6-8%

O：20-23%

S：0-4%

N：15-18%

微量元素：P、Fe、Zn、Cu、I等

當(dāng)前第4頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)當(dāng)前第5頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)食品中蛋白質(zhì)來源Thesourceofproteininfood

動(dòng)物中蛋白質(zhì)；如豬肉、魚肉、雞肉、乳

植物中蛋白質(zhì)：如大豆、谷物

微生物中蛋白質(zhì)：酵母哪種食物中蛋白質(zhì)含量最高？當(dāng)前第6頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)當(dāng)前第7頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)當(dāng)前第8頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)蛋白質(zhì)系數(shù)測定方法一、利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率等測定（定氮法、雙縮脲法、物理法)

二、利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測定(染料結(jié)合法等）最常用的是凱氏定氮法，測得粗蛋白質(zhì)含量當(dāng)前第9頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)第二節(jié)

凱氏定氮法（KjedahlMethod,1833）(GB)一、常量凱氏定氮法（丹麥化學(xué)家凱道爾(JohanKjedahl)首創(chuàng)）

1、

原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化(digest)，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出。而樣品中的有機(jī)氮(organicnitrogen)轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。

當(dāng)前第10頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)①樣品消化(sampledigestion)

：消化方程式

2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4

＝(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O

濃硫酸：脫水性，氧化性脫水炭化氧化有機(jī)物C、H、NCO2、SO2當(dāng)前第11頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)N+SO2

NH3+SO3當(dāng)前第12頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)當(dāng)前第13頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)

加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間1）硫酸鉀提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物分解，與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度純硫酸，沸點(diǎn)，340℃左右，加硫酸鉀，提高至400℃以上，

原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故沸點(diǎn)升高當(dāng)前第14頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，銨鹽分解。也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀當(dāng)前第15頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)（2）硫酸銅CuSO4

催化劑

凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多，還有氧化汞、汞、硒粉、二氧化鈦等（效果、價(jià)格、環(huán)境污染），應(yīng)用最廣泛的是硫酸銅使用時(shí)常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機(jī)物氧化，

當(dāng)前第16頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)作用機(jī)理還可指示消化終點(diǎn)的到達(dá)，蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。當(dāng)前第17頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)②蒸餾(neutralizationanddistillation)

消化完全的樣品溶液，濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↓＋Na2SO4＋2H2O當(dāng)前第18頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)當(dāng)前第19頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)③吸收與滴定(titration)

吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液滴定：鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，

硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用當(dāng)前第20頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)

也可采用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，然后再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液反滴定吸收液中過剩的硫酸或鹽酸，從而計(jì)算總氮量。當(dāng)前第21頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)2、適用范圍（application)

此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定。

3、主要儀器凱氏燒瓶定氮裝置

4、試劑

5、操作方法當(dāng)前第22頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)當(dāng)前第23頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)樣品+硫酸銅+硫酸鉀+濃硫酸45度角先小火炭化，無泡沫后，加大火力，液體變藍(lán)綠透明，繼續(xù)加熱微沸30分鐘NaOH+水硼酸+指示劑玻璃珠當(dāng)前第24頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)6、結(jié)果計(jì)算當(dāng)前第25頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)7、說明及注意事項(xiàng)①

試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制當(dāng)前第26頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)

（11）蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源，否則可能造成吸收液倒吸。

(12)混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。甲基紅:紅-(橙)-黃，溴甲酚綠:黃-(青藍(lán))-藍(lán)，當(dāng)前第27頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)二、微量凱氏定氮法1、

原理及適用范圍同常量凱氏定氮法2、

主要儀器凱氏燒瓶（100ml)微量凱氏定氮裝置(p222)3、

試劑0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液其他同常量凱氏定氮法4、

操作方法稀釋消化液，定容餾出液用0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)，同時(shí)作一空白試驗(yàn)5、

結(jié)果計(jì)算當(dāng)前第28頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)當(dāng)前第30頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑變?yōu)榫G色開始計(jì)時(shí)繼續(xù)蒸餾10分鐘后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。當(dāng)前第31頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)三、自動(dòng)凱氏定氮法1、

原理及適用范圍同常量凱氏定氮法2、

主要儀器自動(dòng)凱氏定氮儀消化裝置3、

試劑硫酸銅和硫酸鉀制成片劑當(dāng)前第32頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)全自動(dòng)凱氏定氮儀當(dāng)前第33頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)第三節(jié)

蛋白質(zhì)的快速測定法雙縮脲法紫外分光光度法染料結(jié)合法水楊酸比色法當(dāng)前第34頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)一、雙縮脲法1、原理當(dāng)脲小心地加熱至150～160℃時(shí)，可由兩個(gè)分子間脫去一個(gè)氨分子而生成二縮脲（也叫雙縮脲），反應(yīng)式如下：當(dāng)前第35頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)

雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)當(dāng)前第36頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)

蛋白質(zhì)分子含有肽鍵,

與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能呈現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸收光度法來測定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長為560nm。當(dāng)前第37頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)2、方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法靈敏度低，但操作簡單快速，故在生化領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類油料、米、谷等作物種子及肉類等樣品測定。3、

主要儀器4、

試劑（1）堿性硫酸銅溶液①

以甘油為穩(wěn)定劑②

以酒石酸鉀鈉作穩(wěn)定劑配制試劑加入硫酸銅溶液時(shí)，必須劇烈攪拌，否則將生成氫氧化銅沉淀（2）四氯化碳當(dāng)前第38頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)5、

操作方法①

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制凱氏定氮法測出的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣顯色（加入試劑靜置1小時(shí)）比色（取上清離心）②

樣品的測定顯色比色查標(biāo)準(zhǔn)曲線

當(dāng)前第39頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)6、結(jié)果計(jì)算蛋白質(zhì)（mg/100g）=式中：c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)mg數(shù)；

m—樣品質(zhì)量，g當(dāng)前第40頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)二、紫外分光光度法

1、

原理蛋白質(zhì)及其降解物（眎、胨、肽和氨基酸）的芳香環(huán)殘基

在紫外區(qū)內(nèi)對一定波長的光具有選擇吸收作用。在此波長（280nm）下，光吸收程度與蛋白質(zhì)濃度(3～8mg/ml)成線性關(guān)系當(dāng)前第41頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)2、

適用范圍本法操作簡便迅速，常用于生物化學(xué)研究工作，

許多非蛋白質(zhì)成分在紫外區(qū)也有吸收作用，光散射作用的干擾，在食品分析領(lǐng)域中的應(yīng)用并不廣泛，最早測定牛乳的蛋白質(zhì)含量，也可測小麥面粉、糕點(diǎn)、豆類、蛋黃及肉制品中的蛋白質(zhì)含量當(dāng)前第42頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)3、主要儀器紫外分光光度計(jì)離心機(jī)4、試劑

1mol/L檸檬酸水溶液

8mol/L尿素的2mol/L氫氧化鈉溶液

95%乙醇無水乙醚當(dāng)前第43頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)5、操作方法①

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取試樣2.00g，+0.1mol/L檸檬酸,四層紗布過濾，離心上清液+脲的氫氧化鈉溶液，至透明比色，8mol/L脲的氫氧化鈉溶液作參比②

樣品的測定

當(dāng)前第44頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)6、結(jié)果計(jì)算蛋白質(zhì)（mg/100g）=

中c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)mg數(shù)；

m—樣品質(zhì)量，g當(dāng)前第45頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)三、染料結(jié)合法

1、

原理

凡是來源相同的蛋白質(zhì)，堿性（或酸性）氨基酸的含量，大體上是相同的。利用這個(gè)特點(diǎn)，加入過量的酸性（或堿性）染料，使其和蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而沉淀析出。用分光光度計(jì)測定未反應(yīng)的染料量，然后根據(jù)算出來的結(jié)合染料量求出蛋白質(zhì)含量。當(dāng)前第46頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)2、

適用范圍本法適用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力飲料、脫脂乳粉等食品。當(dāng)前第47頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)3、

主要儀器分光光度計(jì)組織搗碎機(jī)離心機(jī)當(dāng)前第48頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)4、

試劑5、

操作方法

(1)樣品處理：（2）染料結(jié)合：（3）過濾離心：（4）比色：

當(dāng)前第49頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

(6)測樣當(dāng)前第50頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)四、水楊酸比色法

1、

原理樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化而轉(zhuǎn)化成銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度條件下可與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成藍(lán)色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，進(jìn)而可計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。2、

主要儀器分光光度計(jì)恒溫水浴鍋當(dāng)前第51頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)3、

試劑①

氮標(biāo)準(zhǔn)溶液②

空白酸溶液③

磷酸鹽緩沖溶液④

水楊酸鈉溶液⑤

次氯酸鈉溶液4、操作方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制樣品處理：消化樣品測定：稀釋，取樣測定

當(dāng)前第52頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液于25ml容量瓶、比色管2ml空白酸工作液、5ml磷酸鹽緩沖液、水至15ml、5ml水楊酸鈉，36-370C恒溫水浴15分鐘加入次氯酸鈉2.5ml，恒溫水浴15分，加水至標(biāo)線660nm比色當(dāng)前第53頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)5、

結(jié)果計(jì)算當(dāng)前第54頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)6、

說明①樣品消化完全后當(dāng)天進(jìn)行測定結(jié)果的重現(xiàn)性好，但樣液放至第二天比色即有變化②溫度對顯色影響極大，故應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度。對谷物及飼料等樣品的測定證明，此法結(jié)果與凱氏法基本一致當(dāng)前第55頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)蛋白質(zhì)氮和非蛋白質(zhì)氮的測定

利用蛋白質(zhì)能與重金屬離子（如Cu2+、Hg2+、Pb2+等）結(jié)合形成蛋白質(zhì)鹽而變性沉淀的特性，在一定的條件下，將蛋白質(zhì)氮和非蛋白質(zhì)氮分離.然后用凱氏定氮法分別進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)沉淀劑:常用的有氫氧化銅、醋酸鉛、三氯乙酸、單寧等.當(dāng)前第56頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)第五節(jié)

氨基酸總量的測定

雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法茚三酮比色法(ninhydrinmethod)當(dāng)前第57頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)雙指示劑甲醛滴定法

1、原理氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定-COOH基，并用間接的方法測定氨基酸總量。當(dāng)前第58頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)2、方法特點(diǎn)及應(yīng)用此法簡單易行、快速方便在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。當(dāng)前第59頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定時(shí)也會(huì)消耗一些堿而致使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果偏高。當(dāng)前第60頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)3、試劑

40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。0.1%百里酚酞乙醇溶液（）0.1%中性紅50%乙醇溶液（）0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液當(dāng)前第61頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)4、操作方法樣品溶液(氨基酸約20-30mg)2份，+50ml蒸餾水

1份，+3滴中性紅指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定（紅色—琥珀色，終點(diǎn)）1份，+3滴百里酚酞指示劑+中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定（淡蘭色，終點(diǎn)）分別記錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。當(dāng)前第62頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)5、結(jié)果計(jì)算當(dāng)前第63頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)6、說明及注意事項(xiàng)此法適用于測定食品中的游離氨基酸固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進(jìn)行測定。萃取可在500C水浴中進(jìn)行0.5小時(shí)即可。當(dāng)前第64頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和-COOH基時(shí)的pH為，但分析結(jié)果稍偏低，雙指示劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確。若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定，或用電位滴定法進(jìn)行測定。當(dāng)前第65頁\共有76頁\編于星期六\10點(diǎn)二、電位滴定法

1、

原理根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以