第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法1()

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)當(dāng)前第1頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)(lightmicroscopy)

二、電子顯微鏡技術(shù)(Electromicroscopy)

三、掃描遂道顯微鏡(Scanningtunnelingmicroscope,STM)

當(dāng)前第2頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)電子顯微鏡掃描隧道顯微鏡光學(xué)顯微鏡0.1nm1nm10nm100nm1μm100μm1mm1cm10μm當(dāng)前第3頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)(一)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡的組成部分：①照明系統(tǒng)，包括光源和聚光器；②光學(xué)放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成③機(jī)械裝置，用于固定材料和觀察方便。當(dāng)前第4頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)光鏡樣本制作:經(jīng)過固定劑因定、包埋、5μm薄切片、觀察常用的固定劑：甲醛等常用的包埋劑：石蠟分辨率：指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。最大分辯率：0.2μm當(dāng)前第5頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第6頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)（二）相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）：1932年P(guān)．Zernike發(fā)明，1953年,諾貝爾物理獎(jiǎng)。最大特點(diǎn)：可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。基本原理：把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。當(dāng)前第7頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同之處：

1.環(huán)形光闌(annular

diaphragm):位于光源與聚光器之間。作用:使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標(biāo)本上。

2.相位板(annularphaseplate):在物鏡中加涂有氟化鎂的相位板，將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。

A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。

B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。當(dāng)前第8頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)微分干涉顯微鏡（differentialinterferencemicroscope）1952年，Nomarski發(fā)明，適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。優(yōu)點(diǎn):能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像，立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作(基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因)。當(dāng)前第9頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)原理:利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像立體感更強(qiáng)。錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）計(jì)算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活細(xì)胞中的顆粒細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。當(dāng)前第10頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)(三)熒光顯微鏡技術(shù)(FluorescenceMicroscopy)原理與應(yīng)用：利用較短波長(zhǎng)的光使樣品受到激火，產(chǎn)生較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光，可作觀察和分辯樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分和位置。包括：直接熒光標(biāo)記技術(shù);間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

當(dāng)前第11頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)Singapore’sNationalInstituteofEducationUKUniversityofFloridaFrenchSingaporeSouthKorea當(dāng)前第12頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)(四)激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（Laser

ScanningConfocalMicroscopy）

原理與應(yīng)用：利用共焦光路和激光掃描技術(shù)獲取生物樣品不同層面的圖像，再通過計(jì)算機(jī)組合成三維重構(gòu)的影像。排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第13頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)二、電子顯微鏡技術(shù)（一）電子顯微鏡的基本知識(shí)（二）主要電鏡制樣技術(shù)（三）掃描電鏡Scanningelectronmicroscope，SEMScanningprobemicroscope，SPM當(dāng)前第14頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)（一）電子顯微鏡的基本知識(shí)顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM200nm可見光（400-700nm）玻璃透鏡不要求真空利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化TEM0.2nm電子束（0.01-0.9nm）電磁透鏡1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差1.電鏡與光鏡的比較當(dāng)前第15頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)2.電鏡與光鏡光路圖比較當(dāng)前第16頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)3.電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)當(dāng)前第17頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第18頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)Figure:Earlyimagesofcells.(A)Drawingsofalivingplantcell(ahaircellfromaTradescantiaflower),observeddividingintotwodaughtercellsoveraperiodof2.5hoursbyEduardStrasburgerin1880.(B)Acomparablelivingcellphotographedrecentlythroughamodernlightmicroscope.(B,courtesyofPeterHepler.)當(dāng)前第19頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)（二）主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)(ultrathinsection)：用于電鏡觀察的樣本制備。

固定樣品：鋨酸和戊二醛包埋：環(huán)氧樹脂，進(jìn)樣：以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片厚度：40～50nm，染色：采用重金屬鹽染色，以增大反差。當(dāng)前第20頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）：負(fù)染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。AB當(dāng)前第21頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。膜質(zhì)雙分子層的疏水?dāng)嚆K碳當(dāng)前第22頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第23頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quickfreezedeepetching）特點(diǎn)：富有立體感不需包埋不需固定保持樣品的真實(shí)結(jié)構(gòu)主要用于觀察胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白當(dāng)前第24頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)4.電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段當(dāng)前第25頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)5.掃描電鏡技術(shù)掃描電鏡(Scanningelectronmicroscope，SEM)電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題當(dāng)前第26頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第27頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第28頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)三、掃描遂道顯微鏡

（ScanningtunnelingMicroscope,STM）(80年代發(fā)展起來的檢測(cè)樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器)包括：SPM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。分辯率：0.1－0.2nm;縱分辯率：0.001nm當(dāng)前第29頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)1000g10min20000g20min80000g1h150000g1h細(xì)胞勻漿細(xì)胞核線粒體、溶酶體、微體、高爾基體沉淀含有過氧化酶體等囊泡核糖體、大分子復(fù)合物

*g=1.12×r×n2×10-5r:半徑;n:每分種旋轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、離心技術(shù)用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物當(dāng)前第30頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)差速離心(differentialcentrifugation):利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，將各種亞組分和顆粒分開。密度梯度離心(densitycentrifugation):不同組分以不同有沉降速率沉降，形成不同的沉降帶。沉降速率與物質(zhì)的形態(tài)和大小有關(guān)，以沉降系數(shù)(S值)表示。CsCl法：CsCl可自行形成密度，所以不必特別制備密度梯度，只要將分離的樣品與之混勻既可。在離心的過程中，具有不同密度的顆粒隨CsCl密度梯度的形成重新分配；當(dāng)前第31頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)蔗糖和甘油的最大密度為1.3g/cm3，所以只能用于分離在1.3g/cm3以下的細(xì)胞器或細(xì)胞結(jié)構(gòu)；而CsCl的最大密度可達(dá)1.9g/cm3以上，可用于分離密度大于1.3g/cm3的DNA分子。*在原理上,由于具有不同密度的顆粒隨CsCl密度梯度的形成重新分配，所以又稱為浮力密度離心；而蔗糖和甘油則是在被離心的物質(zhì)在下降的過程中由于密度的不同而被阻止在不同的部位,故是重力密度離心。當(dāng)前第32頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)密度梯度離心densitycentrifugation當(dāng)前第33頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)等的顯示方法（細(xì)胞化學(xué)法）原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布與含量。DNA分布：Feulgen反應(yīng)原理：切片先用稀鹽酸處理使DNA，分子中脫氧核糖與嘌呤之間的連接鍵打開，形成醛基，再與Schiff試劑作用使細(xì)胞核DNA顯紫紅色。

*Schiff試劑：無色亞硫酸品紅復(fù)合物當(dāng)前第34頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第35頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)多糖的存在：PAS（periodicacidSchiffreaction）原理：過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變?yōu)橐叶┗?，后者繼而與Schiff試劑結(jié)合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。顏色反應(yīng)的深淺取決于組織內(nèi)多糖的乙二醇分子的多寡。當(dāng)前第36頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第37頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)蛋白質(zhì)的檢測(cè)：Million反應(yīng)原理：氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應(yīng)形成紅色沉淀。脂類脂類物質(zhì)包括脂肪和類脂：原理：標(biāo)本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。多用蘇丹染料、油紅O、尼羅藍(lán)等溶于脂類的染料染色，使脂質(zhì)呈色。也可用四氧化鋨（OSO4）染色，脂肪酸或膽堿可使OSO4還原為OSO2而呈黑色。當(dāng)前第38頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)三、特異蛋白抗原的定位與定性（免疫細(xì)胞化學(xué)）免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescencetechnique)：將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合用來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。特點(diǎn)：快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)。當(dāng)前第39頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第40頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第41頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)Getonemoretechniquemolecularbiologicalanalysis

Southernhybridization當(dāng)前第42頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第43頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)免疫電鏡技術(shù)：免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用：通過對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等當(dāng)前第44頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)體外培養(yǎng)的BHK－21細(xì)胞經(jīng)選擇性抽提后用抗Mr280×103核骨架蛋白抗體進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記的結(jié)果LYTUCellBiology當(dāng)前第45頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第46頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交技術(shù)：用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定特殊核苷酸序列要染色體上或細(xì)胞中的位置的方法稱為原位雜交。光鏡水平的原位雜交技術(shù)（insituhybridization(同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）電鏡水平的原位雜交技術(shù)（insituhybridization）（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）當(dāng)前第47頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)PLETHORAproteinsasdose-dependentmasterregulatorsofArabidopsisrootdevelopment當(dāng)前第48頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)1、PCR技術(shù)對(duì)于已知全部或部分核苷酸序列的基因,可以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),以基因組DNA或cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段。當(dāng)前第49頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第50頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)2、實(shí)時(shí)定量PCR(RealtimequantitativePCR)實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。當(dāng)前第51頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)非特異性熒光標(biāo)記：（1）SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：（2）TaqMan（3）MolecularBeacon1）DNA

產(chǎn)物的熒光標(biāo)記當(dāng)前第52頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)（1）SYBRGreen法

工作機(jī)理SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光；變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光在延伸結(jié)束階段采集熒光信號(hào)。SYBRGreen也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做熔解曲線分析。當(dāng)前第53頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)SYBRGreenI染料法當(dāng)前第54頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)SYBRGreenI熒光染料在PCR過程中染料與DNA結(jié)合發(fā)光。當(dāng)前第55頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)

PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化SYBRGreen使用濃度:

太高：抑制Taq酶活性，

太低：熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè)Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同當(dāng)前第56頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第57頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)對(duì)DNA模板沒有選擇性--適用于任何DNA使用方便--不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對(duì)引物特異性要求較高當(dāng)前第58頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)（2）TaqMan法TaqMan探針(TaqManProbe)水解型雜交探針TaqMan探針是一段被設(shè)計(jì)成可以與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA(50-150bp)。5‘-3’-端帶有短波長(zhǎng)和長(zhǎng)波長(zhǎng)的兩個(gè)不同的熒光集團(tuán)，因兩個(gè)基團(tuán)的距離很近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移的作用下會(huì)發(fā)出熒光粗滅。當(dāng)前第59頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)檢測(cè)活體中生物大分子納米級(jí)距離和納米級(jí)距離變化的有力工具,檢測(cè)某一細(xì)胞中兩個(gè)蛋白分子是否存在直接的相互作用。當(dāng)前第60頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)490nm熒光供體（CFP）430nm激發(fā)光受體（YEP）當(dāng)前第61頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)受體（YEP）490nm熒光供體（CFP）430nm激發(fā)光530nm黃色熒光FRET當(dāng)前第62頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)TaqMan探針的三個(gè)要素1）一端的短波長(zhǎng)的熒光集團(tuán)2）一段目的DNA特異堿基序列3）一段長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光集團(tuán)。當(dāng)前第63頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)TaqMan法5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針當(dāng)前第64頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)TaqMan探針定量原理當(dāng)前第65頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)TaqMan法PCR反應(yīng)的建立1、引物、探針的設(shè)計(jì)：探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃、2、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：

95℃,3min94℃，15S60℃，60S（Taq酶5′→3′外切酶活性在60℃最高也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度）3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)/背景比值

引物濃度：50-900nM

探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同40cycles當(dāng)前第66頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)Taqman法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列的高特異性--陰性結(jié)果確定引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)性比較好只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高當(dāng)前第67頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動(dòng)態(tài)利用放射性同位素的電離輻射對(duì)乳膠的感光作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定位的一種細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。步驟:同位素標(biāo)記的生物大分子前體摻入；細(xì)胞內(nèi)同位素所在位置的顯示。當(dāng)前第68頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光顯微分光光度測(cè)定法可見光顯微分光光度測(cè)定法流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；分離DNA含量不同的中期染色體。

當(dāng)前第69頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第70頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作系統(tǒng)一、細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)類型：

原代培養(yǎng)細(xì)胞(primaryculturecell)：取下細(xì)胞、組織的器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)(1-10代以內(nèi))。傳代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）：適應(yīng)在體外培養(yǎng)的持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。

當(dāng)前第71頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)細(xì)胞株(cellstrain):正常二倍體，接觸抑制細(xì)胞系(cellline):亞二倍體，接觸抑制喪失，色體明顯改變，容易傳代培養(yǎng)。常用的細(xì)胞系：Hela細(xì)胞系(子宮頸瘤細(xì)胞)BHK21(Babyhamsterkidney)CHO(chinesehamsterovary)*培養(yǎng)細(xì)胞一般不保持體內(nèi)原有細(xì)胞形態(tài)，存在形態(tài)：成纖維樣細(xì)胞(fibroblastlikecell)上皮樣細(xì)胞(epitheliallikecell當(dāng)前第72頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)培養(yǎng)方法：貼壁培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)原代培養(yǎng)的步驟：取組織塊，剪碎，消化分散細(xì)胞連接處(胰酶或EDTA)，無菌、培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

細(xì)胞系(Cellline)：在培養(yǎng)條件下可進(jìn)行無限分裂的動(dòng)物或植物細(xì)胞群。

細(xì)胞株(Cellstrain):通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志(Marker)的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株，細(xì)胞株的特定性質(zhì)功標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期始終保持。當(dāng)前第73頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)貼壁培養(yǎng):分散的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快(幾十分中至幾小時(shí))就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁，貼壁后的細(xì)胞形態(tài)形成多態(tài)，呈單層生長(zhǎng)，所以此法又叫單層細(xì)胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)的細(xì)胞保持接觸抑制特性。懸浮培養(yǎng):懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不貼壁，一直懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。如T細(xì)胞的培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)條件較為復(fù)雜，難度也大一些，但是容易同時(shí)獲得大量的培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)前第74頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)植物細(xì)胞類型：?jiǎn)伪扼w細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細(xì)胞培養(yǎng)） 非細(xì)胞體系（cell-freesystem）LYTUCellBiology當(dāng)前第75頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)二、細(xì)胞工程細(xì)胞分化的定向誘導(dǎo)：基因工程組織工程細(xì)胞融合：雜種細(xì)胞單克隆抗體顯微注射克隆動(dòng)物當(dāng)前第76頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)2.細(xì)胞融合技術(shù)：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長(zhǎng)命(K?hler和Milstein,Jerne)1984年Nobel生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)當(dāng)前第77頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)3.雜交瘤細(xì)胞的篩選：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長(zhǎng)期存活不能長(zhǎng)期存活當(dāng)前第78頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)HAT培養(yǎng)基篩選原理DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(HypoxanthineGuzninePhosphoribosylTransferase)次嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase,TK)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)當(dāng)前第79頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)漿細(xì)胞自發(fā)或誘發(fā)突變脾B細(xì)胞用SRBC免疫(注射X蛋白)不能在HAT培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的骨髓細(xì)胞(帶有X蛋白的抗體)細(xì)胞融合轉(zhuǎn)到HAT培養(yǎng)基上非融合細(xì)胞死亡雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)當(dāng)前第80頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)在多孔塑料板孔內(nèi)培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞(HAT培養(yǎng)液)培養(yǎng)2周雜交瘤細(xì)胞可繼續(xù)繁殖優(yōu)良雜交瘤細(xì)胞檢測(cè)單克隆抗體接種動(dòng)物,大量生產(chǎn)單克隆抗體細(xì)胞大量培養(yǎng)罐大量生產(chǎn)克隆抗體冷凍保藏淘汰不合格的細(xì)胞親代死亡當(dāng)前第81頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第82頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第83頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第84頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)使用與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)藕聯(lián)的親脂性或親水性的熒光分子,如GFP,LUC等檢測(cè)活體表面或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn)動(dòng)以及各種結(jié)構(gòu)上分子動(dòng)態(tài)變化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定區(qū)域的熒光不可逆的猝滅。光漂白的恢復(fù)可通過非漂白區(qū)的熒光分子在膜上或胞質(zhì)中運(yùn)動(dòng)至光漂白區(qū)來完成。一、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)(Fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP)第四節(jié)細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化當(dāng)前第85頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第86頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)二、酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeasttwo-hybridsystem）真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)（modular）特征，這些蛋白往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（bindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。當(dāng)前第87頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\21點(diǎn)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）能與特定基因啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基因轉(zhuǎn)錄。由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活